[发明专利]使用由两个载体表达的拆分的Cas9的基因组编辑

权利要求书

1.一种将靶向突变导入到基因组中的体外方法，其包括将表达包含Cas9蛋白质的N末端的第一结构域的重组载体和表达包含Cas9蛋白质的C末端的第二结构域的重组载体中的每个都导入到细胞中，其中所述第一结构域和所述第二结构域是通过切割所述Cas9蛋白质中的SEQ ID NO:10的连接子的中间部分而构建的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9蛋白质为野生型Cas9、失活的Cas9(dCas9)或Cas9切口酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述失活的Cas9为包含与dCas9结合的FokI核酸酶结构域的RFN(RNA引导的FokI核酸酶)、或与转录激活因子或阻遏物结构域结合的dCas9。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述Cas9切口酶为D10A Cas9或H840A Cas9。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9蛋白质衍生自选自下组的任一种：化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、无害李斯特菌(Listeria innocua)和变形链球菌(Streptococcus mutans)。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体为质粒载体、粘粒载体或病毒载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述病毒载体选自下组：逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。

8.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过融合由所述导入的重组载体中的每个表达的所述第一结构域和所述第二结构域而形成Cas9蛋白质的步骤。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结构域和所述第二结构域中的每一个由具有范围在400bp(碱基对)至3.7kbp(千碱基对)的大小的核苷酸序列编码。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结构域和所述第二结构域中的每一个分别还包含NLS(核定位信号)序列、HA-标签序列、剪接供体序列、剪接受体序列或其组合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一结构域由SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码，而所述第二结构域由SEQ ID NO：5的核苷酸序列编码。

12.根据权利要求1所述的方法，其还包括在所述导入到细胞中的步骤中将序列特异性引导RNA导入到细胞中的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中导入每个载体和所述引导RNA是以同时、顺序或反向的方式实施的。

14.一种组合物，其包含表达包含Cas9蛋白质的N末端的第一结构域的重组载体和表达包含Cas9蛋白质的C末端的第二结构域的重组载体，其中所述Cas9蛋白质中的SEQ ID NO:10的连接子的中间部分被切割而构建所述Cas9蛋白质的所述第一结构域和所述第二结构域。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物用于调节基因表达。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物还包含序列特异性引导RNA。

17.一种用于调节基因表达的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求14所述的组合物。