[发明专利]键形成酶的活性测定

说明书

本文报道了用于检测样品中分选酶的方法，其包括以下步骤：a)将样品与包含固定标签的第一底物和包含可检测标记的第二底物孵育，由此在样品中分选酶的存在下，形成包含固定标签和可检测标记的缀合物，b)通过/使用固定标签将步骤a)的缀合物固定至固相，c)通过/使用可检测标记检测固定的缀合物，并且从而检测样品中的分选酶。

本发明一般地涉及键形成酶的存在和/或活性的检测。特别地本发明涉及分选酶的存在和/或活性的检测。

背景技术

键形成酶，如分选酶和谷氨酰胺转移酶，在工业和生物转化过程中变得越来越重要。为了使用该酶作为生产工具，有必要确定其性质。

酶测定法是确定某些酶活性的方法。这是研究酶特异性或动力学所必需的。处理显色或荧光底物或如NAD的辅助因子的酶易于监测。在相当长一段时间这些测定法是已知的，并且针对多种酶已经开发了标准的活性测定法。这些测定法中的大多数是快速和容易执行的。然而，许多酶不利用显色或荧光底物或辅助因子。例如，在本文中用作通常的键形成酶的代表的键形成酶分选酶，是这种情况。

公开了多种方法来监测键形成酶的反应。通常使用的是质谱法或HPLC，用于测定离析物和产物之间的重量或疏水性变化。然而，这些方法是复杂、耗时并且难于并行执行的。此外，SDS-PAGE可用于研究键形成酶反应的离析物和产物的大小差异。

在分析酶反应的早期研究(Ton-That等人，PNAS 96(1999)12424-12429)中，在没有任何动力学数据的仅仅是定性的研究中使用了SDS-Gel和HPLC分析组合。在Ton-That等人(J Biol Chem 275(2000)9876-9881)中显示了分选酶反应的动力学数据。其中使用质谱法、HPLC和吸光度测量的组合。然而，由于信号仅仅来自LPETG底物的裂解而不可能监测转肽反应。

在Li等人(Chinese Journal of Biotechnology 30(2)(2014)284-293)中报道了通过SDS-PAGE监测分选酶A催化的蛋白质连接效率的报告系统。

Oteng-Pabi等人(Analytical Biochemistry 441(2013)169-173)报道了经释放的NH3的用于微生物谷氨酰胺转移酶活性的连续酶联测定法。

在Matsumoto等人(Journal of Biotechnology 152(2011)37-42)中报道了使用分选酶A的位点特异性四聚体链霉亲和素-蛋白质缀合。

在Frankel等人(Biochemistry 44(2005)11188-11200)中描述了对金黄色葡萄球菌分选酶转肽酶SrtA中反向质子化催化机制的动力学机制和证据的见解。

因此，需要提供快速、可靠、有效、灵敏、可重复和易于进行的测定法来检测键形成酶。

发明概述

本文报道了用于检测键形成酶，特别是分选酶的存在和/或活性的方法和测定法。

更详细地，已经发现，通过本发明的方法可以建立检测键形成酶活性的测定法，其比常用的方法更快、更灵敏、可再现、可靠和/或适合于快速筛选。除了其他方面之外，在本文报道的方法中不仅可以测量部分反应，该部分反应就和在仅可检测到第一裂解反应的一些市售分选酶测定法的情况一样。反而在本发明中，只要发生完全反应时就可以检测键形成酶的活性。例如已经发现，通过检测报告酶与实体的成功连接反应，可以检测键形成酶(例如分选酶)的活性，该实体本身可以结合到固相，例如多孔板或珠。本文报道的方法相对于目前已知的方法具有改善的性质，其中速度、复杂性、稳健性、再现性和灵敏度中的至少一个得到改善，目前已知的方法如基于高效液相色谱(HPLC)的方法或在Matsumoto等人(Langmuir 28(2012)3553-3557)中报道的方法。

本文报道的一个方面是用于检测样品中键形成酶的方法，包括以下步骤：