[发明专利]稳定的反应混合物

说明书

本发明提供了稳定的干燥的反应混合物、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述稳定的干燥的反应混合物在许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增中是有用的。

技术领域

本发明提供了稳定的反应混合物、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述稳定的反应混合物在许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸扩增中是有用的。

背景技术

为了解决生产稳定的多肽组合物的挑战，通常以固体形式制备蛋白质来提供可接受的贮存期限。一种用于制备固体形式蛋白质组合物的标准方法是冷冻干燥(冻干)，但是该方法会产生应激，所述应激可以使蛋白质在不同程度上变性(Wang, W. (2000)International Journal of Pharmaceutics 203; 1-60)。很少有生物反应化合物会以溶解形式稳定任何时间长度，且这对于室温贮存而言是特别真实的。结果，已经执行众多研究来评价增强处于干燥形式的生物反应化合物的贮存能力的可能性。普遍接受的是，为了确保例如聚合酶在再溶解以后的生物活性，必须使用至少一种稳定性添加剂。

WO 2008/36544描述了为了提供干燥的组合物的所谓的填充材料的应用，所述填充材料是例如碳水化合物诸如聚蔗糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、葡聚糖或甘露醇，蛋白质诸如BSA、明胶或胶原，和聚合物诸如PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在美国专利号5,098,893、5,200,399和5,240,843中进一步描述了用于稳定生物试剂的形成玻璃的填充材料。填充材料聚蔗糖是在美国专利号3,300,474中公开的共聚物。干燥液体反应混合物的方法在大多数情况下在性质上是非常复杂的，且因此，干燥程序是严苛的和昂贵的。

冻干(美国专利号5,593,824)或真空干燥(美国专利号5,565,318)被用于干燥在碳水化合物聚合物基质中的生物学材料。冷冻干燥或冻干是充分确立的用于贮存蛋白质的技术，其被公开在许多现有技术文件中(例如Passot, S., 等人, PharmaceuticalDevelopment and Technology 12 (2007) 543-553; Carpenter, J. F., 等人,Pharmaceutical Research 14(8) (1997) 969-975; Schwegman, J. J., 等人,Pharmaceutical Development and Technology 10 (2005) 151-173)。

在美国专利号7,407,747中描述了不同反应混合物的干燥条件的选择，所述反应混合物用于包含Taq聚合酶的遗传修饰的测序应用。使用的干燥程序是冻干、没有额外热的真空离心蒸发（speedvac）、具有额外热的真空离心蒸发和在室温风干。关于多种冷冻保护剂诸如海藻糖、蔗糖、葡萄糖和三甲胺-N-氧化物(TMANO)，测试了在该专利内的反应混合物。此外，还在根本没有冷冻保护剂的情况下执行实验，但是没有公开关于那些反应混合物随时间的稳定性的数据。仅对于包含海藻糖和牛血清白蛋白质(BSA)的反应混合物报道了长达8周的良好稳定性。

此外，美国专利号7,407,747公开了使用在不同测序混合物中的聚合酶的实验，其中每种测序混合物包含缓冲溶液、核苷酸三磷酸、以及具有荧光标记和引物的核苷酸的不同组合物。但是，没有公开是否可以在不影响聚合酶的PCR活性的情况下干燥和储存用于实时PCR扩增的混合物（即包含缓冲溶液、核苷酸三磷酸、引物和检测探针的混合物）中的聚合酶。

美国专利号8,652,811公开了一种干燥在实时PCR混合物内的Taq DNA聚合酶的方法，而得到的干燥的组合物可以在不影响耐热性DNA聚合酶的PCR性能的情况下储存。

发明概述

本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR (逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定的反应混合物，其包含在不需要冷冻干燥或冻干下已经干燥的糖(例如，蔗糖)。本发明也提供了用于制备干燥的反应混合物的方法。