[发明专利]体外胆汁排泄测定法

说明书

发明背景

经常不期望通过肝脏中的首次通过代谢从动物的循环系统中除去治疗性化学实体。如果化学实体被肝细胞摄取并且经由胆小管在胆汁中排泄，则化学实体将永远不会达到其治疗靶标。对于肝细胞而言内源性的转运蛋白负责将底物移动过肝细胞的窦状膜，然后进入胆小管。胆小管是肝组织中的结构，其从肝细胞接收排泄的组分，并将胆汁转运到胆总管以从动物中除去。因此，底物的胆汁排泄是一种复杂的过程，其涉及穿过窦状膜的移位、经由细胞质的运动、和穿过小管膜的转运。

母体药物或其代谢物的肝胆排泄经常在药物的总体清除中起重要作用的理解已经迫使制药行业探索更好的体外工具来预测这种清除途径。出于此原因，化学实体用作药物的合适性的重要决定因素是其受胆汁排泄的程度及其对其它化学实体的胆汁排泄的影响两者。

本领域已经教导了化学实体的胆汁清除的两种一般类型的体外测定法。第一种测定类型是利用两种平行的肝细胞培养物的双培养测定形式。(BI,Yi-an等,“Use of cryopreserved human hepatocytes in sandwich culture to measure hepatobiliary transport,”Drug Metab Dispos.,Vol.34,No.9,pp.1658-65(2006)；ANSEDE,John H.等,“An In Vitro Assay to Assess Transporter-Based Cholestatic Hepatotoxicity Using Sandwich-Cultured Rat Hepatocytes,”Drug metabolism and Disposition,Vol.38,pp.276-280(2010).)。在第一培养物中，将肝细胞暴露于正常的培养基并且形成并维持小管。在第二培养物中，将肝细胞暴露于设计用于破坏小管的培养基，如不含钙和镁的培养基。然后，将化学实体暴露于每种培养物，并允许与肝细胞相互作用达一定培养期。然后，清洗培养物，并评估每种培养物中与细胞相关的化学实体的量。在第一培养物中，与细胞相关的化学实体在胆汁排泄后可以定位于细胞细胞质中或存在于小管中。在第二培养物中，没有完整的小管，因此与细胞相关的任何化学实体必须存在于细胞质中。通过从存在于细胞质和小管(第一培养物)中的化学实体的量中扣除存在于细胞质(第二培养物)中的化学实体的量，可以测定在第一细胞培养物的胆汁中排泄的化学实体的量。

双培养测定形式具有若干缺点。第一项缺点是简单的现实，即使用这种测定形式创建单一胆汁排泄数据点需要原代肝细胞的两种培养物。原代肝细胞难以获得，因此非常昂贵。因此，本领域需要使用较少的原代肝细胞来表征化学实体的胆汁排泄的方法。显然，一种培养方法将使测定法需要的原代肝细胞数目减少50％，因此是非常期望的。第二项缺点是必然在双培养测定法中通过测量两种不是胆汁积累的值，即总细胞积累(细胞质和胆汁)和细胞质积累，然后计算这些值之间的差来计算化学实体的胆汁积累。利用这种双培养方法做出的测量将比胆汁积累的单一直接测量具有更多的固有变异性。胆汁积累的直接测量在双培养测定形式中是不可能的。

本领域还已经教导了化学实体的胆汁清除的单一培养物体外测定法。(美国专利号7,604,934)。然而，先前教导的测定法是间接的。具体地，它依赖于将单一培养物暴露于标志物化合物(如放射性标记的化合物)，并且在存在和缺乏测试化学实体的情况下比较放射性标志物的胆汁积累。此类测定法假设在存在测试化学实体的情况下标记物的胆汁积累的下降指示测试化学实体通过与由标志物化合物使用的途径类似的途径排泄。此测定形式具有几项缺点，包括低精确性。

出于所有上述原因和其它原因，本领域中需要评估化学实体(如候选治疗剂)的胆汁排泄的新的且有效的方法。本发明提供了满足这些和其它需要的新的且非显而易见的方法。

发明概述

本发明提供了表征化学实体的胆汁排泄的新的且改善的体外方法。在第一方面，方法包括：a)提供包含形成至少一个胆小管的肝细胞的细胞培养物；b)使所述细胞培养物与第一化学实体接触足以允许由所述培养物中的肝细胞摄取所述化学实体的时间；c)在不裂解所述肝细胞的情况下破坏所述至少一个胆小管，并且检测由所述至少一个胆小管释放的所述第一化学实体和/或其代谢物的量(如果有的话)；并且d)裂解所述肝细胞，并检测由所述肝细胞释放的所述第一化学实体和/或其代谢物的量。在一些实施方案中，在步骤a)和b)之间、步骤b)和c)之间、和/或步骤c)和d)之间包括至少一个清洗步骤。