[发明专利]检测镰状细胞病的方法以及实施该方法的试剂盒

说明书

本发明涉及镰状细胞病测试领域。更具体地，本发明涉及一种使用来自个体的血样进行这种测试的方法，并且涉及一种用于实施根据本发明的测试镰状细胞病的方法的试剂盒以及自动化设备。

镰状细胞病，也称为镰状细胞性贫血，是由包含在红细胞中的血红蛋白的异常引起的常染色体隐性遗传病，具体来说是血红蛋白的β-链的结构异常，其特征在于该β-链的氨基酸从谷氨酸突变为缬氨酸。

镰状细胞病是全世界最主要的血红蛋白病。接近1.2亿个个体被认为是镰状细胞性状的携带者。

镰状细胞病发现于印度次大陆的某些地区、南美洲以及地中海盆地。热带非洲，即位于南纬15度至北纬20度之间的区域受影响最大，比率为每65位婴儿中大约1例镰状细胞病。受影响最大的国家是刚果民主共和国、塞内加尔、贝宁和安哥拉。这可能与这些区域中的抗疟疾性有关，此支持了镰状细胞病起因于抗疟疾性的自然选择过程的假设，因为疟原虫在镰状细胞中难以进行其循环。

在法国，纯合镰状细胞病首次出现于1200年。其为法兰西岛的主要遗传风险。在西印度群岛，比率达到每260位婴儿中1例。镰状细胞病也影响美国黑人，这源于该群体在美国诞生的历史起源，即大量非洲人在三角贸易的背景下被驱逐出境，他们的后代现今仍然受到镰状细胞病的影响。

因此，镰状细胞病是真正的公共健康问题，更加因为没有出现临床症状的健康携带者可能不知道他们能够将这种疾病传递给后代。世界卫生组织预测，血红蛋白异常的携带者的数量在几十年内将达到全世界人口的8%。

目前，存在若干用于测试或诊断镰状细胞病的测试。这些测试尤其基于异常血红蛋白（称为血红蛋白S）的特性。这些特性例如为，在脱氧状态下溶解度降低和形状改变，称为镰变。在缺氧条件下，红细胞的血红蛋白进行凝胶化并聚合成纤维，该纤维使红细胞延伸变形，从而使其呈镰刀状。

因此，血红蛋白的异常镰状性质可通过称为伊塔诺测试（test ITANO）的不溶性测试，或通过如埃姆尔测试（test d’Emmel）等缺氧诱导的镰变测试来检测。具体来说，本领域技术人员所熟知的埃姆尔测试包括使血样与还原剂接触，以触发镰状红细胞的镰变现象，并在显微镜下观察该还原剂对红细胞形状的影响。不过，这些测试需要特定的实验室设备。此外，这些设备是非自动化的。

目前所用的其它鉴别测试基于电泳技术、高效液相色谱法（HPLC）技术或分子生物学技术，特别是用于检测血红蛋白的核苷酸序列中限制位点的消失的技术，或聚合酶链式反应（PCR）技术。这些测试除了需要特定且昂贵的设备之外，还需要操作者具有专业知识，且操作费时。

本发明旨在克服现有技术中检测个体的镰状性质的方法的缺点，特别是上述缺点，其通过提供一种使用来自个体的血样测试镰状细胞病的方法来实现，该方法能够获得可靠结果并且其实施容易且迅速。本发明还旨在降低与实施该方法相关的成本。

本发明的另一个目的是，能够在无需特定且复杂的设备或具有大量专业知识的操作者的情况下，或者通过一种自动化设备来实施该方法。

为此，本发明有利地利用由镰状细胞病个体产生的血红蛋白S的特性，即在缺氧条件下红细胞内的聚合性质。如上所释，在缺氧条件下，胞内聚合物的形成引起血红蛋白细胞骨架的改变，造成镰变现象和红细胞脱水以及硬化。这些红细胞畸变会导致血管闭塞危机，其为镰状细胞病的主要并发症。

本发明人已发现，虽然正常的红细胞能够变形，且能够容易地穿过比其直径小很多，特别是比其直径小几微米的孔，但已经发生镰变现象的镰状红细胞因其特定的镰刀形状和其特定的刚度特性而不可变形或几乎不可变形且不能穿过与上述孔具有相同尺寸的孔。因此，本发明人已发现，通过使用具有适当孔径的膜来过滤血样，正常的红细胞与镰状红细胞的变形性的差异使得能够区分来自镰状细胞病患者的血样与来自正常患者的血细胞的血样。

因此，本发明提供一种测试个体镰状细胞病的方法，其包括以下连续的步骤，步骤a/和b/可连续或同时进行：

a/ 使来自一个待测试以确定其是否患有镰状细胞病的个体的血样与诱导镰状红细胞镰变的试剂接触，即与一种能够将血样中含有的红细胞置于缺氧条件下的试剂接触，以引起镰状红细胞的镰变；

b/ 使用多孔膜过滤含有红细胞的血样，特别是可能已经发生镰变现象的红细胞的血样，其中该多孔膜的孔径利用以下方式确定：该多孔膜能够阻挡已经镰变的红细胞穿过，并允许未经镰变的红细胞穿过；以及

c/ 在过滤步骤b/期间和/或过滤步骤b/结束时，检测膜上可能存在的残余物，残余物的存在与个体具有镰状细胞病特征的事实相关。