[发明专利]糖底物的酶促转磷酸化

说明书

本发明涉及通过酶促转磷酸化制备糖磷酸酯的方法，其中磷酰基从磷酸供体底物转移到糖底物是由具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶催化。在另一方面，本发明涉及具有蔗糖磷酸化酶以及α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的生物催化剂及其用途。根据另一方面，本发明还涉及具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶的制备及其在糖底物的转磷酸化中的用途。

糖底物的磷酸化是对细胞代谢至关重要的常见生化转化(1-3)。其通常涉及磷酰基从磷酸化活化的供体底物(例如ATP)转移至糖主链上的受体基团(4-7)，通常为羟基。各种磷酸转移酶催化糖的磷酸化(8-12)。在由糖苷磷酸化酶催化的备选反应中，其中磷酸化仅在糖的异头位置发生，糖基残基从糖供体底物转移至磷酸盐(图1A)(13-14)。与糖连接的磷酸酯部分是生物识别的关键要素，例如整个糖酵解的所有步骤，并且其用于引导糖在不同生物化学途径中进一步转化(15-18)。从细胞内代谢物分析研究中已知，常见的糖磷酸酯(例如D-葡萄糖-6-磷酸酯，Glc-6-P；D-果糖-6-磷酸酯，Fru-6-P)的浓度变化通常与细胞生理的主要改变相关(19-22)。由于在不同生物学研究中对可靠的参考材料的需求，对糖磷酸酯的合成制备(20)有相当大的兴趣。技术上来说，糖磷酸酯作为营养补充剂和增味剂应用于食品和饲料产品；作为化妆品中的保湿成分；作为洗涤剂中的离子型表面活性剂；以及作为新聚合物的结构单元(23-25)。

已经成功开发了天然已知的磷酸化反应，用于糖磷酸酯的生物催化合成。糖基转移至磷酸酯基本上限于应用在己糖-1-磷酸酯产物，并且糖苷磷酸化酶反应的相对较窄的底物范围限制一个至仅几个糖基磷酸酯，其已在制备规模上证明能有效生产(例如α和β-Glc-1-P(26,27)，α-D-半乳糖-1-磷酸酯(28))。相反，磷酸转移酶反应提供了方便获得多种糖磷酸酯产物的途径，如多种己糖底物通过例如糖激酶的核苷三磷酸依赖性磷酸化所示(29-33)。然而，磷酸化活化的供体底物的高成本和由所得的脱磷酸化产物(例如来自ATP的ADP)引起的酶抑制需要磷酰基供体仅以催化量提供，并因此在反应期间被连续再生(图1B)(34,35)。这使得生物催化的磷酰基转移成为技术上复杂的整体转化，目前在糖磷酸酯合成中使用有限。

在其天然的磷酸单酯水解反应的改变中，磷酸酶催化的转磷酸化被认为是糖磷酸酯的替代途径(图1C)(36-39)。在糖以足以有效地超出与水反应的浓度存在的条件下，一些磷酸酶(例如酸性磷酸酶)以中等(例如D-甘露糖-6-磷酸酯；15％)至优良的产率(例如Glc-6-P；高达95％)(37)促进糖磷酸酯的形成。使用合适的磷酰基供体底物例如无机焦磷酸盐或寡磷酸盐是有利的。然而，供体底物水解的高度优势、糖磷酸酯产物的快速二次水解以及所释放的磷酸的组合抑制和质量作用效应(图1C)是磷酸酶催化合成的关键问题(40,41)。因此，仍然需要确认具有改善的合成效力的转磷酸化系统。

本发明的目的是提供用于以高产率有效生产糖磷酸酯的系统。特别地，本发明的目的是提供用于从多种磷酸供体底物向糖底物的酶促磷酰基转移的方法和材料。

本发明的发明人能够证明，具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶能够有效地催化多种磷酸供体和糖底物之间的转磷酸化反应，因此是用于灵活的生成糖磷酸酯的非常有效的工具。

因此，上述的本发明的目的通过以下方法来实现：一种通过酶促转磷酸化制备一种或多种糖磷酸酯的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供一种或多种糖底物，

(ii)提供一种或多种磷酸供体底物，

(iii)提供α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶，

(iv)将步骤(i)中提供的一种或多种糖底物和步骤(ii)中提供的一种或多种磷酸供体底物与步骤(iii)中提供的α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶在允许转磷酸化的条件下一起温育，

(v)任选地，纯化在步骤(iv)中获得的一种或多种糖磷酸酯。

在本发明的上下文中，术语转磷酸化是指一个或多个磷酸基团从供体底物向受体底物的转移。

在本发明的上下文中，底物可以是能够在一个或多个位置提供或接受一个或多个磷酸基团的任何分子。特别地，本发明上下文中的底物是磷酸化或未磷酸化的碳水化合物，例如醛糖或酮糖。