[发明专利]DNA的合成

说明书

本发明涉及用于合成DNA、RNA、蛋白质及类似分子的改进的方法，尤其是DNA的无细胞酶促合成，优选以大的规模。本发明涉及使用链置换复制的DNA合成，且控制向反应混合物添加核苷酸，从而控制产率。反应混合物含有起始量的核苷酸、聚合酶和DNA模板，以受控的方式向其供给另外的核苷酸。

领域

本发明涉及用于合成DNA、RNA、蛋白质及类似分子的改进的方法，尤其是DNA的无细胞酶促合成，优选以大的规模。

背景

脱氧核糖核酸(DNA)的扩增可以通过使用基于细胞的方法来进行，例如通过在发酵罐中培养增殖待扩增的DNA的细菌。也已经描述了用于从起始模板扩增DNA的无细胞酶促方法，包括聚合酶链反应和链置换反应。

过去，已使用基于微孔板和自动控制的移液管的装置添加所需的反应成分来实施测试规模的DNA扩增。这样的装置和方法适用于生产少量的DNA分子以用于测试目的，但不提供足够的用于其他目的的量。特定核酸和蛋白质的大规模扩增和生产大部分是通过基于细胞的方法进行的。这样的方法通常有效地生产非常大体积的产物，但其设置是昂贵的。

也有很多可用的装置，其特别适应于使用热循环(thermocyclic)方法引起聚合酶链反应(PCR)来扩增DNA样品。这些装置理想地适于该反应，但其是不灵活的，不能适应于实施其他反应。这种装置的实例公开在US 8,163,489中。

已知使用化学合成(如亚磷酰胺法)的大规模DNA合成，但其并非没有缺点。反应通常必须在有机溶剂中进行，这些有机溶剂中的许多是有毒的或者有害的。化学合成的另一缺点是，其并非完全有效率，因为在每次添加核苷酸之后，至少2％的生长中的寡核苷酸链被封端，导致产率损失。因此，被合成的核苷酸链的总产率损失随着向序列中添加的每个核苷酸而增加。化学合成寡核苷酸的这种固有的无效率性最终将能够有效生产的寡核苷酸的长度限制在具有50个核酸残基或以下的寡核苷酸。

到目前为止，还未常规地研究将生物催化剂，例如聚合酶，用于工业规模地生产DNA产物，且反应在很大程度上被限制于微升规模的体积。使用DNA的酶促合成的放大方法已被证明是有问题的，尤其是DNA产物令人失望的产率。

因此，存在对能够用于以显著的规模合成DNA及类似分子的方法的需要。

概述

本发明涉及涉及用于无细胞生产DNA的方法。该方法可以允许与目前的涉及封闭的分批过程的方法相比增强的DNA生产。这显著增加生产率，同时降低合成DNA的成本，尤其是以大的规模。本发明一般性地涉及扩增DNA的等温方法，其不要求通过加热和冷却使温度循环。

因此，提供了一种用于合成DNA的无细胞方法，包括使DNA模板与至少一种聚合酶在一种或多种引物和核苷酸的存在下、在促进所述模板扩增的条件下接触，以形成反应混合物，所述模板扩增是通过另一条链的链置换复制来置换经复制的链，其中以受控的方式向反应混合物供给另外的核苷酸(further nucleotides)。

因此，无细胞方法涉及模板经由链置换复制的扩增。提供了一种用于合成DNA的无细胞方法，包括使DNA模板与至少一种聚合酶在一种或多种引物和核苷酸的存在下、在促进所述模板通过链置换复制而扩增的条件下接触，以形成反应混合物，其中以受控的方式向反应混合物供给另外的核苷酸。

因此，还提供了一种用于合成DNA的无细胞方法，包括使DNA模板与至少一种聚合酶在核苷酸的存在下、在促进所述模板扩增的条件下接触，以形成反应混合物，所述模板扩增是通过另一条链的链置换复制来置换经复制的链，其中以受控的方式向反应混合物供给另外的核苷酸。

因此，无细胞方法涉及模板经由链置换复制的扩增。提供了一种用于合成DNA的无细胞方法，包括使DNA模板与至少一种聚合酶在核苷酸的存在下、在促进所述模板通过链置换复制而扩增的条件下接触，以形成反应混合物，其中以受控的方式向反应混合物供给另外的核苷酸。