[发明专利]修饰型β-半乳糖苷酶

说明书

技术领域

本发明涉及β-半乳糖苷酶。详细而言，涉及来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的修饰以及修饰型酶的用途等。本申请基于2014年8月19日申请的日本专利申请第2014-166897号要求优先权，参照并引用该专利申请的全部内容。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是水解β-D-半乳糖苷键使D-半乳糖游离的酶，一般广泛存在于微生物和动植物中。β-半乳糖苷酶别名被称为乳糖酶。另外，β-半乳糖苷酶还具有使半乳糖苷键转移的能力，已知有利用该能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖残基的低聚糖)的方法。

已知米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxinus)、细菌环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等产生β-半乳糖苷酶。其中，来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶(专利文献1，非专利文献1)是能够用乳糖生成低聚半乳糖的酶，是工业上制造低聚半乳糖的重要的酶(例如，以“BIOLACTA”的商品名销售β-半乳糖苷酶制剂)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2010/140435号小册子

非专利文献

非专利文献1：Song，J.，Abe，K.，Imanaka，H.，Imamura，K.，Minoda，M.，Yamaguchi，S.，&Nakanishi，K.(2010).Causes of the production of multiple forms of β-galactosidase by Bacillus circulans.Bioscience，biotechnology，and biochemistry，75(2)，268-278.

发明内容

就低聚糖的制造而言，向底物糖类(乳糖等)添加酶后，通常加热进行。在该酶反应中，为了提高底物的溶解度、防止杂菌的污染等，优选反应温度尽可能的高。已知利用酶的转糖基作用通常底物浓度越高效率越好地进行。另外，高温的情形由于底物的溶解度高，所以能够提高底物浓度。因此，工业生产中特别期望酶的耐热性的提高。另一方面，报告了利用酶工程技术等进行酶的修饰时酶的稳定性降低。虽然酶的性质被改良，但是酶的稳定性(耐热性等)受到影响，也存在不能实现实用化的情形。在这样的情形中，进一步施加修饰，如果能够提高酶的稳定性，会向实用化大大前进。

因此本发明的课题在于提供低聚糖的制造等中有用的提高β-半乳糖苷酶的耐热性的技术、其产物以及用途等。

根据目前的研究，得知环状芽孢杆菌生产的β-半乳糖苷酶由分子量不同的4种酶，即，分子量195kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-A，序列号1)、分子量160kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-B，序列号2)、分子量135kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-C，序列号3)、和分子量86kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-D，序列号4)构成。其中BgaD-D是具有酶活性的最小尺寸的β-半乳糖苷酶，转糖基活性最高。由于该特性，BgaD-D在低聚糖的制造中特别有用。关注这一点，尝试确定BgaD-D的立体结构。具体而言，采用使用0.4M柠檬酸三钠盐二水合物(sodium citrate tribasic dihydrate)、1.0M三水合醋酸钠(sodium acetate trihydrate)(pH4.0)、25％w/v聚乙二醇(Polyethylene glycol)3350作为沉淀剂的悬滴式液蒸汽扩散法，使用精制成高纯度的BgaD-D以结晶化为目标。需要约1年的时间，但是不均匀溶液的界面附近仅成功发现3个结晶。从其中选择结晶，尝试装入结晶结构解析用装置。其结果，1个结晶中，成功收集其反射数据。因此，使用本数据，利用相位决定软件进行约2周的计算。其结果，幸运地成功确定BgaD-D的立体结构。接下来，在立体结构信息的基础上确定预计对耐热化有效的氨基酸，导入突变。详细研究各突变体的特性的结果，3个突变点对耐热化有效。进一步的研究结果表明通过组合有效的突变，耐热性进一步提高。下述的发明主要基于以上的成果以及考察。