[发明专利]用于检测水解β‑内酰胺环抗微生物剂的酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗生素抗性检测领域。

特别地，本发明涉及一种用于检测β-内酰胺酶活性的方法，包括在电化学电池中使疑似含有所述酶活性的样品与至少一种包含β-内酰胺环的底物接触，以及测量电化学电池中的阻抗参数细胞。本发明特别用于检测产生产生碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)。

发明背景

存在对快速检测生物细胞中的β-内酰胺酶活性的需求，特别是用于诊断导致感染的病原体介质或用于检测耐药性病原体的传感器和方法。

碳青霉烯目前是用于治疗由产生广谱β-内酰胺酶(ESBL)的多重耐药肠杆菌科菌株引起的严重感染的首选药物。最近在肠杆菌科中出现的碳青霉烯抗性越来越多地被报道，如今成为重大临床关注点。肠杆菌科的碳青霉烯抗性或降低的易感性的最常见机制，包括具有低碳青霉烯水解活性的β-内酰胺酶(头孢菌素酶或ESBL)的存在，以及由于孔蛋白丢失或改变导致的通透性降低。碳青霉烯抗性也越来越多地源自于Ambler A类(主要是KPC)、B类(主要是VIM、IMP、NDM)或D类(主要是OXA-48)碳青霉烯酶的生产。

考虑到碳青霉烯类抗性扩散的风险，因此强烈地需要能够以高置信度和高特异性检测产生碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的快速方法和装置。

目前，在临床实验室中对此类病原体的完全鉴定需要长达72小时，包括建立抗性谱，然后通过表型测试或分子方法确认检测碳青霉烯酶的存在。

碳青霉烯酶基因的分子鉴定是有局限性的，因为它只允许检测特定的细菌和/或抗性基因，并且还特别昂贵，因为它需要特定的仪器、消耗品、熟练人员且通常还要专用室。

目前，大多数用于检测产生碳青霉烯酶的生物体的方法基于表型和基因型方法。

参考表型方法在于，通过将所述疑似病原体在限定浓度的该抗微生物剂的存在下，在固体琼脂板或液体培养基中培养数小时，定性或定量地确定疑似病原体对抗微生物剂的抗性。然后进行需要24小时以上培养的确认测试，以确定对碳青霉烯的抗性是否源于碳青霉烯酶或其他机制(盘组合测试，“Hodge测试”)。这些方法耗时且缺乏灵敏性和特异性。

还有几种更直接的方法也曾得到开发，包括依赖于通过抗性菌株产生的β-内酰胺酶进行直接β-内酰胺水解观察的方法。碳青霉烯酶类的β-内酰胺酶的亚胺培南水解如下所示：

碳青霉烯更具体而言是亚胺培南的水解，可以使用内源或外源比色法来监测。当指示剂是β-内酰胺的亚分子部分时，该方法视为内源比色法；当指示剂仅是与所选β-内酰胺一起加入的另一种试剂时，该方法是外源比色法。

在现有的内部法中，betaLACTA^TM测试(Bio-Rad，Marnes-la-Coquette，France)依赖于显色头孢菌素HMRZ-86，其光化学性质强烈依赖于β-内酰胺酶对β-内酰胺进行解环。水解的分子从黄色变成红色，并且可以通过肉眼检测。然而，这种显色分子不能检测OXA-48碳青霉烯酶。

最近，Nordmann、Poirel和Dortet开发了碳青霉烯酶活性特异性检测的外源比色法，称为“CarbaNP-测试”。该测试特别基于一项观察结果，即亚胺培南水解导致其β-内酰胺环打开并形成一个或多个羧酸官能团。然后，可以用酚红作为酸碱比色指示剂来容易地监测由此得到的酸度增加。然后用肉眼估计苯酚红色变化。该方法允许在约3小时内检测产生碳青霉烯酶的生物，并且旨在消除使用需要额外延时进行诠释的表型/基因型确认测试的需要。然而，CarbaNP测试需要制备pH颜色指示剂和不同的试剂，并且需要预先裂解程序以释放反应介质中的β-内酰胺酶。此外，根据几项研究，CarbaNP-测试仍然缺乏对产生OXA-48的生物的检测灵敏性。这种方法的另一个缺点是其依赖于肉眼操作者的观察，这是主观的，特别是当颜色并非直观的黄色而是橙色时，而且当前的实验室信息管理系统(LIMS)不容易追踪临床实验室等。