[发明专利]通过数字化转座子的单倍体组测定

说明书

在某些实施方案中，本发明提供了在进一步分析之前通过使用转座酶将差异条形编码的转座子插入基因组DNA中而“数字化地”标记不同染色体的不同等位基因的方式。根据该方法，每个等位基因变得标记有独特的转座子条形码模式。由于每种独特的转座子条形码模式标识出特定的等位基因，因此该方法有利于确定倍性和拷贝数变异，提高辨别纯合子、杂合子和由测序错误产生的模式的能力，并允许将由不提供信息的DNA段隔开的基因座鉴别为连锁基因座，从而有利于单倍型确定。还提供了一种新的人工转座子末端，其包括在两个或更多个位置的条形码序列，这些位置对于转座不是必需的。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年5月23日提交的第62/002,733号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。

关于对联邦资助的研究与开发下作出的发明享有权利的声明

不适用。

技术领域

本发明总体上涉及利用转座子确定单倍体组(haploidome)的领域。在特定的实施方案中，本发明涉及利用数字化的转座子由单细胞高分辨率地确定完整单倍体组的方法和组合物。

背景技术

已经充分证明，通过基于PCR的扩增或通过等温扩增进行的全基因组扩增通常导致有偏差的扩增，从而致使一些区域扩增过度，而另一些区域扩增不足。这种偏差使得拷贝数变异(CNV)难以确定，并且使单核苷酸多态性(SNP)或单核苷酸变异(SNV；即突变)的鉴定或“判定”具有挑战性。

已经采用多种计算机程序来帮助解决这些问题。然而，由于扩增的无序性，常常难以确定观察到的CNV是真实的还是扩增的假象。此外，大多数计算机程序基于每个基因组由44条常染色体和两条性染色体组成的假设而运行，但并非所有细胞均如此，而且对于癌细胞来说肯定不是这样，癌细胞可在癌细胞系内和癌组织内的细胞之间在拷贝数方面表现出巨大差异。

具体而言，核型分析研究已发现，一些正常的哺乳动物细胞具有高倍性。单细胞可含有4、6、8条或多达数百条全套染色体。这些细胞在整个基因组中具有一致的拷贝数变化。因此，利用常规测序方法或PCR无法确定这些细胞的绝对拷贝数，原因在于这些方法全部依赖于染色体上的至少一个参考点，该参考点可能是基因或区段或整个染色体。

肿瘤组织中或已确立的肿瘤细胞系中的肿瘤细胞的核型倾向于甚至更加复杂且不均匀。染色体数目常常从少于46条(亚倍体)至92条(四倍体)不等。在已确立的肿瘤细胞系内或肿瘤组织内的肿瘤细胞由具有不同染色体数目的细胞集合组成，并且特定染色体，例如染色体1，可在一个细胞中以1个拷贝，或2个拷贝，或5个拷贝，或6个拷贝，或7个拷贝存在，但在另一个细胞中可能缺失，这都增加了复杂性。因此，对于此类肿瘤细胞系，染色体1的平均拷贝数可以为分数。因为七个染色体1之一上的一个突变将由14％的读序(reads)来表示，所以对于类似于此的情况，突变“判定”极具挑战性。

此外，在癌症研究中的罕见突变检测中，即使在“深度测序”的帮助下，测序中约1％的典型错误率也常常导致数以亿计的测序错误。这些分散的错误在一些应用中可以被容忍，但如果在次要等位基因中出现罕见突变，则在鉴定细胞群体以及单细胞中的超罕见突变时会变得非常成问题。

发明内容

在各个方面，本文预期的发明可包括但不必限于以下实施方案中的任一个或多个：

实施方案1：一种试剂盒，其包含一组两个或更多个转座子，其中每个转座子包含不同的第一转座子条形码序列和位于填充序列侧翼的转座子末端，其中所述转座子各自在所述填充序列中包含相同的第一引物结合位点并且能够被转座酶插入核酸中。

实施方案2：根据实施方案1所述的试剂盒，其中所述第一转座子条形码序列位于转座子末端内或邻近转座子末端。