[发明专利]通过cupin超家族的蛋白质催化的(R)-选择性cupin-硝基醛醇反应

说明书

本发明涉及产生手性β硝基醇化合物的方法。本发明特别涉及可对映选择性催化亨利反应的(R)‑选择性cupin‑硝基醛缩酶，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin‑硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。

发明领域

本发明涉及产生手性β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin-硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。本发明特别涉及对映选择性催化亨利反应的(R)-选择性cupin-硝基醛缩酶。

背景技术

生物催化过程对于化工行业已经变得非常重要。当生物催化剂的性质使两种对映体中的任一种能够与手性或前手性化合物的化学反应中优先反应或形成时，具有特别重要性的是酶的使用。

利用酶的这些有利性质的基本要求是如在工业加工中所需的其足量的低成本的可用性、足够高的反应性、选择性和在工业加工的实际条件下的高稳定性。

β硝基醇为β氨基醇的前体，其是用于生物活性化合物——如用作药物成分的麻黄碱、苯丁抑制素和鞘氨醇——合成的重要的手性结构单元。硝基醛醇(nitroaldol)或亨利反应是用于C-C键形成的有机合成中经典命名反应之一。由于创建达两个新的手性中心的潜力，其能够对映选择性和立体选择性地进行硝基醛醇加成对于合成应用是至关重要的。尽管该反应已经被熟知一个多世纪(Henry，1895)，但是利用非酶有机催化剂或手性金属催化剂的立体特异的方案最近才被开发。这些方法的发展是令人印象深刻，但它们仍然有许多缺点，包括长的反应时间、并在金属催化剂的情况下有时极端的反应条件、或者在有机催化剂的情况下选择性不足。

在过去十年中，第一个不对称的生物催化硝基醛醇反应被发现针对来自热带橡胶树巴西三叶胶(Hevea brasiliensis)(HbHNL)羟基腈裂解酶(hydroxynitrile lyase)(Purkarthofer et al.,Angew Chem Int Ed Engl.2006 45(21):3454-6,Gruber-Khadjawi et al.,Adv.Synth.Catal.2007,349,1445–1450,Yuryev,R.；et al.,Biocatal.Biotransform.,(2010)28,348；Yuryev,R.；et al.；Chemcatchem,(2010)2,981))。

属于α/β水解酶超家族的类似HbHNL的来自木薯(Manihot esculenta)的(S)-选择性MeHNL，也能够催化(S)-选择性硝基醛醇反应，虽然具有较低的活性和选择性。

催化(R)-选择性HNL催化的亨利反应的第一(R)-选择性HNL是来自Arabidobsisthaliana的AtHNL(Fuhshuku et al.J.Biotechnol.2011,153,153-159)，其也属于类似(S)-选择性硝基醛缩酶的α/β水解酶超家族。

相比之下，硝基醛醇反应中的活性到目前为止尚未针对来自属于不同蛋白质折叠的Prunus amygdalus(PaHNL)的(S)-选择性羟基腈裂解酶而显示。

然而，不幸的是，在报告的反应条件下在延长的反应时间(2小时至4小时)内AtHNL的反应产物的对映体过量显著减少，而产率没有增加(Fuhshuku et al.2011)。

施用每mmol苯甲醛40mg AtHNL，Asano和同事实现了具有50％乙酸正丁酯(30％产率和91％ee)的pH为7的两相系统中苯甲醛和MeNO₂的最高对映体选择性。通过施用较大量的酶(100mg每mmol底物)进一步略微改善了产率和对映体过量。根据底物和反应系统，产率达60％或对映体过量达96％可以通过施用每mmol底物40mg AtHNL和2小时的反应时间实现。然而，其在相同的反应条件下不能共存。

然而，在报告的反应条件下在延长的反应时间(2小时至4小时)内AtHNL反应产物的对映体过量显著减少，而产率没有增加。没有使用硝基乙烷。