[发明专利]CRM197和相关蛋白的表达和纯化

说明书

本发明涉及用于生产重组蛋白的细胞、组合物和方法。具体而言，本发明涉及用于从大肠杆菌获得高水平的可溶性重组CRM₁₉₇蛋白的生产方法。细胞优选地包含二硫化物还原酶基因的一个或多个突变，使得二硫化物还原酶活性降低。本发明还涉及CRM₁₉₇的纯化方法以及正确折叠的CRM₁₉₇蛋白的表征。

相关申请的引用

本申请要求2014年1月31日提交的相同标题的美国临时申请号61/934,377的优先权，其整体通过引用特别结合到本文中。

发明背景

1. 发明领域

本发明涉及在细菌宿主中生产重组蛋白的领域。具体而言，本发明涉及用于从大肠杆菌获得高水平的可溶性重组CRM₁₉₇蛋白的生产方法。本发明还涉及CRM₁₉₇的纯化和表征方法以及通过所述方法生产的CRM₁₉₇的用途。

2.背景描述

白喉毒素(DT)是一种由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的致病菌株合成和分泌的蛋白质性外毒素。这些致病菌株包含携带毒素基因的噬菌体溶素原。白喉毒素是一种ADP-核糖基化的酶，其作为535个残基的酶原分泌和由胰蛋白酶-样蛋白酶加工，并释放两个片段(A和B)。片段A使用NAD作为底物，催化在烟酰胺环和N-核糖之间的N-糖苷键的裂解和介导ADP-核糖共价转移(ADPRT活性)至延伸因子EF-2的修饰的组氨酸715(白喉酰胺)。该翻译后白喉酰胺修饰使EF-2失活，停止蛋白合成和导致细胞死亡。DT的A片段(亦称为C结构域)带有催化活性位点，并且是中毒的最后一步所需的唯一毒素片段。B片段上携带的R结构域介导与宿主细胞表面上的受体的结合，并且也在B片段上携带的T结构域促进片段A的pH-依赖性转移至细胞质。富含精氨酸的二硫键连接的环连接片段A与片段B(或者结构域C与结构域TR)。在该链在位置186上蛋白水解裂解后，该链间二硫键是在这两个片段之间唯一的共价连接。各种无毒性和部分毒性的免疫学交叉反应形式的白喉毒素(CRM或交叉反应材料)的分离导致发现CRM₁₉₇ (Uchida等Journal of BiologicalChemistry 248，3845-3850，1973；亦参见Giannini等Nucleic Acids Res. 1984年5月25日;12(10):4063-9)。优选地，CRM可具有包含整个DT或其一部分的任何大小和组成。

CRM₁₉₇是一种主要酶失活和无毒性形式的白喉毒素，其包含单个氨基酸置换G52E。该突变导致NAD-结合位点之前的活性位点环的内在柔韧性，和降低CRM₁₉₇结合NAD的能力并消除DT的有毒性质(Malito等Proc Natl Acad Sci USA 109(14):5229-342012)。如同DT一样，CRM₁₉₇具有两个二硫键。一个二硫键连接Cys186与Cys201，其连接片段A与片段B。第二个二硫键在片段B内连接Cys461与Cys471。DT和CRM197两者均具有片段A-相关的核酸酶活性(Bruce等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87、2995-8、1990)。