[发明专利]CRM197和相关蛋白的表达和纯化

权利要求书

1.生产整个CRM蛋白或其一部分的方法，包括：

提供包含表达载体的重组细胞，其中与未修饰的重组细胞相比，所述重组细胞已被修饰以改变细胞质的氧化还原状态至更加氧化的状态，并且所述表达载体包含与CRM编码序列功能连接的启动子；

诱导所述表达载体以经细胞质生产CRM蛋白；和

分离所表达的CRM蛋白，其中所表达的CRM蛋白是可溶性的。

2.权利要求1的方法，其中所述重组细胞的一种或多种二硫化物还原酶的活性降低。

3.权利要求1的方法，其中所述表达载体包含核糖体结合位点、起始密码子和CRM编码序列上游的表达增强子区。

4.权利要求3的方法，其中所述表达载体在核糖体结合位点和起始密码子之间包含至少一个间隔基。

5.权利要求1的方法，其中所表达的可溶性CRM蛋白包含天然折叠蛋白。

6.权利要求1的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。

7.权利要求1的方法，其中所述重组细胞在15°C至32°C和约37°C的温度下增殖。

8.权利要求1的方法，其中所述CRM蛋白通过色谱法分离。

9.权利要求8的方法，其中所述色谱法包括硫酸酯树脂、凝胶树脂、活性硫酸化树脂、磷酸盐树脂、肝素树脂或肝素-样树脂。

10.生产整个CRM蛋白或其一部分的方法，包括：

提供包含表达载体的重组细胞，其中所述重组细胞的一种或多种二硫化物还原酶的活性降低，和所述表达载体包含与CRM编码序列功能连接的启动子；

经细胞质从CRM编码序列表达CRM蛋白；和

分离所表达的CRM蛋白，其中所表达的CRM蛋白是可溶性的。

11.权利要求10的方法，其中所述重组细胞是大肠杆菌细胞或大肠杆菌的衍生菌或菌株。

12.权利要求10的方法，其中所述一种或多种二硫化物还原酶包括氧化还原酶、二氢叶酸还原酶、硫氧还蛋白还原酶、蛋白还原酶或谷胱甘肽还原酶的一种或多种。

13.权利要求10的方法，其中与非-重组细胞相比，所述一种或多种二硫化物还原酶的活性降低改变重组细胞的细胞质的氧化还原状态至氧化状态。

14.权利要求10的方法，其中所述CRM编码序列编码一个或多个CRM表位、CRM肽序列、CRM结构域或其组合。

15.权利要求10的方法，其中所述CRM编码序列编码CRM₁₉₇。

16.权利要求10的方法，其中所述表达载体包含间隔基。

17.权利要求10的方法，其中所述启动子是组成型启动子。

18.权利要求10的方法，其中表达增强子包含CRM编码序列上游的核糖体结合位点和ATG密码子。

19.权利要求10的方法，其中所表达的可溶性CRM蛋白包含天然折叠蛋白。

20.权利要求10的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。

21.权利要求10的方法，其中所述重组细胞在15°C至32°C和约37°C的温度下增殖。