[发明专利]CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因敲除技术领域，具体涉及 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因 的sgRNA。

背景技术

器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近 百万的患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需 要进行器官移植手术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植 手术的开展。以肾脏移植为例，我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而 可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部分患者死于肾衰竭。依靠死后器官 捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其他物种，以提供合适于 人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。

目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面 评价，猪成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直 接将猪的器官移植到人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪 进行改造，以产生适合于人体移植的器官，成为异种移植的终极目标。

免疫学的研究发现猪的细胞表面表达一种糖类化合物：α-1，3-半乳糖化合 物(α-1，3-Gal)。它的合成依赖于α-半乳糖苷转移酶1(alpha-galactosyltransferase 1，GGTA1)。人类细胞由于缺乏有功能的GGTA1基因，不能合成α-1，3-半乳 糖化合物。而在细菌及非灵长类动物中该类化合物广泛存在。人体在体内细菌 的刺激下会大量产生针对α-1，3-半乳糖化合物的抗体。如果将猪的器官移植给 人，会由于相应的抗体而出现超急性排异反应，导致移植失败。因此，需要消 除猪细胞表面的α-1，3-半乳糖化合物分子以减少异种供体器官的免疫原性。而 准确高效的敲除猪GGTA1基因，是消除α-1，3-Gal引起的免疫排斥的关键步骤。

目前，常见的基因敲除技术包括同源重组(HomologusRecombination，HR) 技术、类转录激活效应子核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease， TALEN)技术、锌指核酸酶(Zinc-FingerNuclease，ZFN)技术以及最近发展的 规律成簇间隔短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromic Repeat，CRISPR)技术。HR技术由于重组效率低下(效率大约只有10^-6)，对 突变体的筛选工作非常耗时和低效，已逐渐被取代。TALEN技术和ZFN技术的 切割效率一般能达到20％，但都需要构建可以识别特定序列的蛋白质模块，前 期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱靶率，其应用有 限。

CRISPR是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合 物由蛋白质Cas和CRISPR-RNA(crRNA)组成。目前该系统已发现有三种类 型，其中第二类Cas9系统组成简单，已被积极应用于基因工程领域。Cas9靶向 切割DNA是通过两种小RNA——crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA (trans-activatingcrRNA)与靶序列互补识别的原理实现的。现在已经将两种小 RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(singleguideRNA)，能够识别特定的 基因序列，引导Cas9蛋白进行切割。在真核生物中，DNA被切断后发生非同源 重组末端连接，造成移码突变，最终导致基因功能性敲除。

相比于上述3种技术，CRISPR技术操作简单、筛选效率高，能够实现精确 的靶向切割。因此，通过CRISPR技术敲除GGTA1基因能够极大地提高α-1， 3-Gal缺失细胞及基因工程猪的筛选效率。但是该路径的关键技术难题是设计并 制备精确靶向的sgRNA，因为基因的靶向精确度高度依赖于sgRNA靶序列，能 否成功设计出精确靶向的sgRNA成为敲除目的基因的关键技术问题，本发明意 在解决该技术问题从而为敲除GGTA1基因提供坚实的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及 用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA。