[发明专利]CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA

权利要求书

1.在运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因中用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA，其特征在于：

（1）所述sgRNA在GGTA1基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链；

（2）所述sgRNA在GGTA1基因上的靶序列位于GGTA1基因的N端的5个外显子编码区，或靶序列的一部分位于GGTA1基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子；

（3）所述sgRNA在GGTA1基因上的靶序列是唯一的。

2.根据权利要求1所述的用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序列为序列表中SEQIDNO：1~38中任一条序列所示的序列。

3.根据权利要求1所述的用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序列为序列表中SEQIDNO：1所示的序列。

4.运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上用于形成粘性末端的序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的两端加上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的所述正向寡核苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；

（2）将所述双链寡聚核苷酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体，得到携带含相应靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆，并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒；

（3）用所述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细胞系包装出同时携带靶向GGTA1基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

（4）使用所述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定GGTA1基因的敲除情况。

5.根据权利要求4所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法，其特征在于，所述表达载体为序列表中SEQIDNO：39所示序列的载体。

6.根据权利要求4或5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上CACCG序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的5’-端加上AAAC序列、3’-端加上C，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的所述正向寡核苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；

（2）将所述双链寡聚核苷酸连入如序列表中SEQIDNO：39所示序列的表达载体lentiCRISPRv2经BsmBI限制性内切酶酶切得到的线性化载体，得到携带sgRNA寡聚核苷酸的重组表达载体lentiCRISPRv2-GGTA1，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆，并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒；

（3）用所述表达载体lentiCRISPRv2-GGTA1、包装质粒和包装细胞系包装出同时携带靶向GGTA1基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

（4）使用所述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定GGTA1基因的敲除情况。

7.根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法，其特征在于，所述包装质粒为质粒pLP1、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG；所述包装细胞系为HEK293T细胞。