[发明专利]一种高效富集血小板的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种高效富集血小板的方法。

背景技术

血小板是一种具有较小体积的无核细胞，小于红细胞和白细胞，只存在于哺乳动物血液中，在正常血液中有较恒定的数量(如人体全血中血小板浓度为1～3×10⁵/ml)，其除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，还能通过胞内α颗粒的脱颗粒作用释放大量细胞生长因子，包括血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，可诱导骨细胞的分裂增殖及胶原合成，促进骨组织的修复与重建。血小板可从患者自身全血中提取，经富集处理后发挥治疗作用，具有来源丰富，取材方便，分离简单等特点，广泛应用于骨科、口腔科、运动医学等领域。

现有的血小板人工富集方法主要采用富血小板血浆(PRP)法，得到PRP用于实验研究和临床治疗。PRP是全血经过离心分离得到的血小板浓缩物，其制备原理是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。全血经低速离心可分为三层，上层是贫血小板血浆层(PPP)、中间为富血小板血浆层(PRP)、下层为红细胞层，取中间层可得到高度浓缩的含血小板血浆。

现有技术例如富血小板血浆(PRP)法主要都是采用从人血里面直接提取血小板，但这样收集得到的血小板的数量有限，并且直接回输血小板后，血小板的增加值低于预期的回升值，即出现血小板输注无效的现象；同时，直接向人体输注血小板也不可避免地增加了血源性感染及输血反应发生的概率，并且我国各大城市的血小板供应存在极大的缺口，因此，临床上急需一种新的替代治疗法来有效的治疗血小板减少症。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种能较快恢复患者血小板数目及功能的高效富集血小板的方法，其不仅临床安全性高，而且可以减少同种免疫抗体的产生，降低输血量及血源性感染的危险。

本发明通过以下技术方案实现该目的：

一种高效富集血小板的方法，将脐血中的巨核细胞分离并进行培养，然后输注入人体内产生大量血小板，每个巨核细胞平均能够产生2000个血小板。

其中，巨核细胞分离培养包括巨核细胞的扩增培养以及巨核细胞悬液的制备步骤。

作为优选的，所述巨核细胞的扩增培养包括以下步骤：

1)用抗凝采血管采集脐血，将100ml脐血与浓度为0.06g/ml羟乙基淀粉混合，脐血与羟乙基淀粉的体积比为3～6：1，充分混匀后静止30min以上，沉降红细胞，吸取上清液，并加至装有等体积的淋巴细胞分离液的离心分离管中，2000rpm离心20min，收集单个核细胞；

2)将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次；

3)将洗涤后的单个核细胞按密度为1×10⁶接种于IMDM培养基中，并加入浓度为50～100ng/ml的rhG-CSF，连续培养7天；

4)将上述步骤3)中的单个核细胞收集离心，1500rpm离心10min后，用StemSpanSFEM无血清培养基重悬，并加入细胞生长因子SCF20～100ng/mL、20～100ng/mLTPO、10～50ng/mLIL-3、20～100ng/mLIL-6、20～100ng/mLIL-11、10～50IU/ml肝素，置于37℃、5％CO₂、5％O₂、90％N₂的条件下培养，每隔2天进行原体积的1/3量的换液，连续培养4～10天；

所述巨核细胞悬液的制备包括以下步骤：

5)将上述培养11～17天的巨核细胞进行收集，1500rpm离心5min，弃上清；

6)将步骤5)获得的巨核细胞用生理盐水重悬，离心1500rpm离心5min，弃上清；

7)最后将收集到的巨核细胞重悬于生理盐水中，制备成巨核细胞悬液。

进一步的，对步骤2)收集的单个核细胞进行计数，单个核细胞数量为(0.85±0.42)×10⁸个，其中巨核细胞占比0.5％左右，取1.0×10⁸个单核球细胞，含巨核祖细胞约(2.82±0.35)×10⁵个。

进一步的，所述步骤3)中经过rhG-CSF刺激培养后，CD34+细胞的含量明显提高10倍左右，达到(2.62±0.57)×10⁶个。