[发明专利]一种高效富集血小板的方法

权利要求书

1.一种高效富集血小板的方法，将脐血中的巨核细胞分离并进行培养，然后输注入人体 内产生大量血小板。

2.如权利要求1所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，巨核细胞分离培养包括巨 核细胞的扩增培养以及巨核细胞悬液的制备步骤。

3.如权利要求2所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述巨核细胞的扩增培养 包括以下步骤：

1)用抗凝采血管采集脐血，将100ml脐血与浓度为0.06g/ml羟乙基淀粉混合，脐血与羟 乙基淀粉的体积比为3～6：1，充分混匀后静止30min以上，沉降红细胞，吸取上清液，并加 至装有等体积的淋巴细胞分离液的离心分离管中，2000rpm离心20min，收集单个核细胞；

2)将收集到的单个核细胞用PBS洗涤，1500rpm离心10min，重复2次；

3)将洗涤后的单个核细胞按密度为1×10⁶接种于IMDM培养基中，并加入浓度为 50～100ng/ml的rhG-CSF，连续培养7天；

4)将上述步骤3)中的单个核细胞收集离心，1500rpm离心10min后，用StemSpanSFEM 无血清培养基重悬，并加入细胞生长因子SCF20～100ng/mL、20～100ng/mLTPO、10～50ng/mL IL-3、20～100ng/mLIL-6、20～100ng/mLIL-11、10～50IU/ml肝素，置于37℃、5％CO₂、5％O₂、 90％N₂的条件下培养，每隔2天进行原体积的1/3量的换液，连续培养4～10天；

所述巨核细胞悬液的制备包括以下步骤：

5)将上述培养11～17天的巨核细胞进行收集，1500rpm离心5min，弃上清；

6)将步骤5)获得的巨核细胞用生理盐水重悬，离心1500rpm离心5min，弃上清；

7)最后将收集到的巨核细胞重悬于生理盐水中，制备成巨核细胞悬液。

4.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，对步骤2)收集的单个核 细胞进行计数，单个核细胞数量为(0.85±0.42)×10⁸个，其中巨核细胞占比0.5％左右，取 1.0×10⁸个单核球细胞，含巨核祖细胞约(2.82±0.35)×10⁵个。

5.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述步骤3)中经过rhG-CSF 刺激培养后，CD34+细胞的含量明显提高10倍左右，达到(2.62±0.57)×10⁶个。

6.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述步骤4)中连续培养 4～10天后，CD34+细胞总数扩增了35.21±1.24倍，其中巨核细胞占细胞总数的70％，即(9.23 ±3.25)×10⁷个。

7.如权利要求3所述的高效富集血小板的方法，其特征在于，所述步骤7)中将巨核细 胞重悬于生理盐水，制备成200ml的细胞悬液，每袋细胞总量控制在0.5～1×10⁷个。