[发明专利]一种多肽聚合物毛细管等电聚焦分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析领域,具体涉及多肽药物的分离分析领域。

背景技术

醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate，缩写为GA)是一种人工合成多肽类混合物(相对分子量：4700-11000道尔顿)，由L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸四个氨基酸所组成的随机聚合物，长为45-100个氨基酸。各氨基酸摩尔比大约为0.392-0.462，0.129-0.153，0.086-0.100，0.300-0.374。该药物由以色列药厂梯瓦制药(TEVA)所研发制造，商品名为于1996年获美国FDA核准用于治疗多发性硬化症，目前有注射用水针和注射用冻干粉针两种产品，均用于皮下注射。

醋酸格拉替雷是一个连续性很强的共聚物，其结构如下式所示：

(Glu，Ala，Lys，Tyr)_x·xCH₃COOH

(C₅H₉NO₄·C₃H₇NO₂·C₆H₁₄N₂O₂·C₉H₁₁NO₃)_x·xC₂H₄O₂

CAS-147245-92-9

对于仿制该药厂商，只能基于该药的一些固有性质来考察仿制醋酸格拉替雷与原研制剂醋酸格拉替雷的组分差异。

利拉鲁肽(Liraglutide)(商品名Victoza)Nove Nordisk 1996年开始研发，2009年最早于丹麦上市的人GLP-1(7-37)的修饰物。从结构上看Liraglutide为GLP-1(7-37)链上34位Lys被Arg取代，在26位的Lys上接入经十六烷酸修饰的谷氨酰胺。GLP-1经脂肪连修饰后的，增加了与白蛋白之间的亲和力，从而降低了被DPP‐Ⅳ的水解速率和肾清除率，延长生物半衰期。Liraglutide的生物半衰期达11～15h，每天只需给药一次皮下注射，大大提高了患者的顺应性。

毛细管等电聚焦(cIEF)是近年来基于平板等电聚焦和毛细管电泳技术发展而来的分析方法，它利用毛细管中灌注的一系列不同等电点的两性电解质混合物在电场下形成的pH梯度，根据多肽或其他待分析物等电点的差异对其进行分离，其分离精度可达到0.1个pH单位，并克服了平板等电聚焦操作复杂、无法实现自动化、无法准确测定电荷异质体含量等缺点，因而被广泛应用于单克隆抗体药物的等电点测定和电荷异质体含量分析。与离子交换色谱相比，毛细管等电聚焦具有分析时间短、样品消耗量小、通用性强等优势，其单个样品分析时间通常是离子交换色谱的1/4，单次测试样品消耗量通常是离子交换色谱的1/10左右，且对一些电荷异质性较为复杂的样品如融合蛋白、多肽混合物样品具有更好的分离效果。

尽管毛细管等电聚焦已经被广泛应用于单抗药物的质量分析，但其应用于多肽混合物药物一致性评价分析还未见报道。

本发明基于本品各组分间等电点的差异，采用毛细管等电聚焦电泳对其进行分析，对比多肽的带电差异，进而分析多肽药物的一致性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速测定多肽聚合物成分和差异的分析方法。该方法具有通用性强、分析周期短、数据处理简单等优点，而且适用于多肽聚合物的生产工艺开发和质量控制。

一方面，本发明提供了一种多肽聚合物的分析方法，其特征在于采用毛细管等电聚焦方法，包括以下步骤：

1)配制毛细管等电聚焦上样液，所述上样液为包括两性电解质、凝胶液、等电点标记物与待分析的多肽聚合物的混合液；

2)将步骤1)的上样液上样于毛细管柱，在15～30℃、10～40kV下聚焦2～25min，在10～40kV迁移20～50min；并通过毛细管等电聚焦仪或毛细管电泳仪检测，得到等电聚焦谱图；

3)通过等电点标记物计算出多肽混合物各组分的等电点，通过各组分等电点数值；

4)采用步骤1)-3)相同条件对多肽聚合物标准品进行检测，将标准品和样品的各组分等电点数值与各组分峰型进行对照。

进一步地，所述凝胶液选自甲基纤维素、尿素、羟丙基甲基纤维素、甘油、蔗糖、精氨酸、亚氨基二乙酸中的一种或多种的混合物。