[发明专利]一种碳纳米管固定化漆酶及其用途

说明书

本发明公开了一种碳纳米管固定化漆酶，其制备方法为先将碳纳米管进行琥珀酰亚胺基的接枝和氨基三乙酸功能团的接枝，再进行铜离子鳌合修饰的表面功能化处理，然后与脱除铜离子的漆酶进行固定化反应；漆酶活性中心与碳纳米管表面功能基团的铜离子直接联接，从而可以实现真正意义的直接电子传递，克服了漆酶蛋白质外壳对电子由活性中心到碳纳米管的直接传递过程产生的屏蔽作用，本发明的碳纳米管固定化漆酶解决了碳纳米管固定化漆酶催化过程中电子传递速率受限的问题，可提高固定化漆酶在生物检测中的灵敏度，将酚类测定时的最低检测限降低85％～96％，在生物燃料电池应用中的电流密度提高80％～120％。

技术领域

本发明涉及漆酶的固定化领域，具体为一种通过漆酶活性中心与碳纳米管连接实现直接电子传递的碳纳米管固定化漆酶及其用途。

背景技术

漆酶(苯二醇∶氧化还原酶，EC l.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶是一种铜蛋白，一般含4个铜离子，根据光谱和磁性特征可将漆酶中的铜离子分为3类：I型Cu、II型Cu、III型Cu；其中I型Cu和II型Cu各1个，是单电子受体，呈顺磁性，可用电子顺磁共振(EPR)测定；III型Cu 2个，是双电子受体，呈反磁性，EPR检测不出来。根据X射线、光谱、磁性和实验事实推测，铜离子的配位结构为：I型Cu分别被与Cys、Phe的2个S，2个His中的N配位，形成变形的四面体；II型Cu是三核簇，分别与两个His中的N和1个O配位，氧化型的漆酶含氧配体可能是H2O或OH－；III型Cu的2个Cu分别与3个His中的N配位，又同时与Tyr中的O配位形成氧桥组成双核铜区。

现有的研究表明铜离子处于漆酶的活性部位，在漆酶的催化氧化过程中起着决定性作用。漆酶是单电子氧化还原酶，它催化不同类型底物氧化反应机理是一种产生自由基的单电子反应，主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同作用。漆酶催化底物氧化反应是通过以下三个主要步骤完成：i)I型Cu从还原型底物接受电子被还原；ii)电子被传递到II型Cu和III型Cu形成T2/T3结构域的三核中心；iii)分子氧被激活并在T2/T3三核结构域被还原成水(Solomon EI,Chen P,Metz M,Lee SK,Palmer AE.Oxygenbinding,activation,and reduction to water by copperproteins.Angew.Chem.Int.Ed,2001,40:4570-4590)。

漆酶是最具有应用前景的氧化还原酶之一，主要用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解等。漆酶在催化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易地被转化为电信号而高灵敏地得到检测，固定化漆酶技术的不断成熟为漆酶在生物检测和生物燃料电池中的应用提供了重要的条件。目前已有报道漆酶电极包括无反应物漆酶电极、双酶电极等。