[发明专利]一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一类多肽序列分析方法的建立，尤其是一种肠道可吸收乳清肽序列分 析方法的建立。

背景技术

乳清蛋白是干酪以及干酪素生产过程中的副产物，其含量占牛乳中蛋白质含量的 18％～20％。利用蛋白酶水解乳清蛋白制备生物活性肽是目前乳清开发的一个方向。生物 活性肽是一类具有生理活性寡肽的统称，现已发现乳清蛋白来源的生物活性肽有降血压 肽、促矿物元素吸收肽、吗啡肽等。这些生物活性肽在被吸收进入人体后能发挥生理调节活 性，因此，乳蛋白来源的生物活性肽有着巨大的开发应用前景。

然而，生物活性肽口服吸收生物利用度低是限制其发展的主要因素，小肠是物质 吸收的主要场所，也是生物活性肽吸收的主要屏障，活性肽经人体口服后，要以完整形式穿 越小肠上皮细胞进入人体体液循环，才能达到生物学功效。目前研究认为，多肽能否以完整 形式由小肠转运至血液，与多肽链长度、肽的氨基酸组成、亲疏水性、带电性均有一定关系， 但现在还没有完全定论，如现在普遍认为二肽和三肽能完整的吸收，三肽以上的多肽能否 完整吸收还存在争议。因此，大于三肽的生物活性肽也可能不被小肠吸收，但是现在还没有 明确的方法来研究能够被小肠完整吸收多肽的序列特征。

Caco-2细胞模型于20世纪70年代首次分离自人类结、直肠癌细胞，培养成熟的 Caco-2细胞即可形成与人体小肠上皮细胞相同的细胞极性和致密的单细胞层组织，其形态 和功能上与人体的小肠上皮细胞相似。在肠腔侧分化出绒毛面AP侧(apical，肠腔侧，又称 黏膜剂)和基底面BL侧(basolateral，肠内壁侧，又称浆膜剂)。AP侧含有典型的小肠微绒毛 水解酶和各种营养物质的转运载体，Caco-2细胞现已被广泛用于药物口服吸收的体外筛选 模型。目前关于利用Caco-2细胞进行活性肽的转运实验只是合成某一种生物活性肽然后进 行肠道转运实验，评价其吸收状况及转运机制，并无利用Caco-2细胞模型研究肠道可吸收 乳清肽的序列的方法。

因此，本发明建立了一种以Caco-2细胞模型，分析肠道可吸收乳清肽序列的方法， 该方法了解到能够由完整形式顺利由小肠转运至血液的多肽结构特征后，能更具针对性地 筛选口服吸收生物利用度高的生物活性肽。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肠道可吸收乳清肽序列的分析方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：a)利用具有特异性酶切位点的蛋 白酶水解乳清蛋白；b)水解结束后酶解液加热灭酶活，离心取上清液为粗乳清肽(A)；c)步 骤b)中的粗乳清肽(A)用截留分子量为10000Da的中空纤维超滤膜超滤，得到乳清肽超滤液 (B)，冷冻干燥备用；d)步骤c)中的乳清肽超滤液(B)用蒸馏水溶解后，经过SephadexG-10 凝胶过滤层析，收集各个分离组分得到纯化乳清肽(C)，冷冻干燥备用；e)构建Caco-2细胞 转运模型；f)步骤d)中分离得到的纯化乳清肽(C)进行Caco-2细胞转运实验，收集Caco-2细 胞基底侧转运乳清肽(D)；g)步骤f)中Caco-2细胞基底侧(BL侧)转运乳清肽(D)用UPLC-MS 分析肽序列。

步骤a)具体包括以下步骤：

a1)乳清浓缩蛋白粉WPC-80溶于蒸馏水，质量浓度为6％，在65℃下恒温加热15～ 30min，使其充分溶解；

a2)乳清蛋白溶液溶解后降至各具有特异性酶切位点的蛋白酶酶解最适温度，调 节乳清蛋白溶液pH至各具有特异性酶切位点的蛋白酶最适水解pH值，分别加入具有特异性 酶切位点的蛋白酶进行水解，添加的各具有特异性酶切位点的蛋白酶量与乳清蛋白粉比为 3％(W/W)，酶解时间为2h。

特异性酶切位点的蛋白酶包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶。

特异性酶切位点的蛋白酶酶解最适温度，碱性蛋白酶的最适酶解温度为55℃，胰 蛋白酶的最适酶解温度为45℃，糜蛋白酶的最适酶解温度为50℃，所述的具有特异性酶切 位点的蛋白酶酶解最适pH，碱性蛋白酶的最适酶解pH为8.5，胰蛋白酶的最适酶解pH为7.5， 糜蛋白酶的最适酶解pH为8.5。

步骤c)中空纤维超滤膜截留分子量为10000Da，超滤膜压力为0.1-0.4Mpa，流速为 5-10mL/min。