[发明专利]一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法

权利要求书

1.一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其特征在于包括以下步 骤：

a)利用具有特异性酶切位点的蛋白酶水解乳清蛋白；

b)水解结束后酶解液加热灭酶活，离心取上清液为粗乳清肽(A)；

c)步骤b)中的粗乳清肽(A)用截留分子量为10000Da的中空纤维超滤膜超滤，得到乳清 肽超滤液(B)，冷冻干燥备用；

d)步骤c)中的乳清肽超滤液(B)用蒸馏水溶解后，经过SephadexG-10凝胶过滤层析， 收集各个分离组分得到纯化乳清肽(C)，冷冻干燥备用；

e)构建Caco-2细胞转运模型；

f)步骤d)中分离得到的纯化乳清肽(C)进行Caco-2细胞转运实验，收集Caco-2细胞基 底侧转运乳清肽(D)；

g)步骤f)中Caco-2细胞基底侧转运乳清肽(D)用UPLC-MS分析肽序列。

2.如权利要求1所述的一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其特 征在于所述步骤a)具体包括以下步骤：

a1)乳清浓缩蛋白粉WPC-80溶于蒸馏水，质量浓度为6％，在65℃下恒温加热15～ 30min，使其充分溶解；

a2)乳清蛋白溶液溶解后降至各具有特异性酶切位点的蛋白酶酶解最适温度，调节乳 清蛋白溶液pH至各具有特异性酶切位点的蛋白酶最适水解pH值，分别加入具有特异性酶切 位点的蛋白酶进行水解，添加的具有特异性酶切位点的蛋白酶量与乳清蛋白粉比为3％(W/ W)，酶解时间为2h。

3.如权利要求1或2所述的一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其 特征在于：所述的特异性酶切位点的蛋白酶包括碱性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶。

4.如权利要求1或2所述的一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其 特征在于：所述的具有特异性酶切位点的蛋白酶酶解最适温度，碱性蛋白酶的最适酶解温 度为55℃，胰蛋白酶的最适酶解温度为45℃，糜蛋白酶的最适酶解温度为50℃，所述的具有 特异性酶切位点的蛋白酶酶解最适pH，碱性蛋白酶的最适酶解pH为8.5，胰蛋白酶的最适酶 解pH为7.5，糜蛋白酶的最适酶解pH为8.5。

5.如权利要求1所述的一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其特 征在于：所述步骤c)中空纤维超滤膜压力为0.1-0.4Mpa，流速为5-10mL/min。

6.如权利要求1所述的一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其特 征在于：所述步骤d)凝胶过滤层析为SephadexG-10，上样体积为2.5mL，上样质量浓度为 30mg/mL，蒸馏水为洗脱液，洗脱速度为2mL/min。

7.如权利要求1所述的一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其特 征在于所述步骤e)具体包括以下步骤：

e1)Caco-2细胞用含10％胎牛血清的、含青霉素80U/mL、链霉素0.08mg/mL的DMEM培养 液，37℃，5％CO₂培养箱，隔天换一次培养液，直至下一次传代；

e2)用DMEM培养液制成细胞悬液，以密度2×10⁵cells/mL接种于12孔Transwell板的滤 膜上；

e3)24h后换培养液，前7天隔天换液，之后每天换液，培养21天；

e4)21天后测定Caco-2细胞模型的各评价指标，跨上皮细胞电阻，碱性磷酸酶活力，荧 光素钠渗漏实验。

8.如权利要求1所述的一种利用Caco-2细胞分析肠道可吸收乳清肽序列的方法，其特 征在于：所述步骤f)用HANKS缓冲液清洗Caco-2细胞，在绒毛面AP侧加入由HANKS缓冲液配 制的纯化乳清肽(C)0.5mL，乳清肽(C)质量浓度为10mg/mL，在BL侧加入HANKS缓冲液1.5mL， 置于37℃，5％CO₂培养箱中转运1h，转运结束后，BL侧取出转运乳清肽(D)，经0.22μm的水系 滤膜过滤后冷冻干燥。