[发明专利]一种用于粪便中艰难梭菌分离培养的试剂的使用方法

说明书

技术领域

本发明属于粪便中艰难梭菌分离培养方法领域，具体涉及用于粪便中艰 难梭菌分离培养的试剂与使用方法。

背景技术

艰难梭菌(Clostridiumdifficile，CD)又名难辨梭菌或难辨梭状芽孢杆 菌，是一种具有芽胞结构的革兰氏阳性严格厌氧杆菌，是全球范围内公认的 医院内感染与抗生素性腹泻最为重要的病原微生物。它能够引起抗生素相关 性腹泻、结肠炎、致死性伪膜性肠炎等。2013年，艰难梭菌被美国国家卫 生部列为抗生素相关耐药菌三大病原菌之首，威胁程度指定为″最紧急″。 2015年2月份发表在《新英格兰医学杂志》的最新文章《美国艰难梭菌感 染的负担》显示，在美国每年感染患者超过50万人，死亡人数超过2.9万， 平均病死率为5.5-6.9％，重症死亡率在60％以上，每年用于治疗的医疗费 用在100亿美金以上。在中国，抗生素滥用和严重，据最新报道艰难梭菌感 染占院内腹泻中患者人数25％以上，抗生素相关腹泻中20-30％；肿瘤放疗 患者中感染患者在30％以上。艰难梭菌感染易出现抗生素耐药、反复复发、 传染性、高致死性；在全球范围内，艰难梭菌早已成为医院感染与抗生素耐 药领域臭名昭著的″超级臭虫″。

细菌培养是临床病原微生物诊断的″金标准″，是病原微生物研究的重 要手段与先决条件。我国已将艰难梭菌研究纳入″十二五″国家传染病重大 科技专项，由于培养分离条件严格苛刻，相关研究报道仍然较少。在临床实 践中，艰难梭菌较难培养，究其原因主要包括两点：(1)艰难梭菌培养条 件较为苛刻，需要严格厌氧条件；(2)粪便中存在大量杂菌，影响艰难梭 菌培养；该点原因为目前艰难梭菌培养不理想的主因。

发明内容

本发明提供一种用于粪便中艰难梭菌分离培养的试剂、该试剂在艰难梭 菌分离培养鉴定等中的应用以及该试剂的具体使用方法，通过上述试剂以及 使用方法，可以抑制粪便中杂菌，并提高艰难梭菌阳性培养率，保证鉴定结 果的准确。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种用于粪便中艰难梭菌分离培养的试剂的使用方法，所述 试剂为硫磺胆酸钠的酒精溶液，在使用时，包括以下步骤：

1)在粪便中加入硫磺胆酸钠的酒精溶液，混合均匀，得到混合体系；

2)将混合体系静置；

3)将步骤2)静置后的混合体系离心，去除悬浮颗粒；

4)取上清，接种到艰难梭菌选择培养基，厌氧条件下培养；

5)挑选表面粗糙、边缘不齐并产特殊气味的黄色菌落，进行革兰氏染色； 革兰氏染色呈阳性并且有明显火柴头状芽孢的菌落判定为阳性，即为艰难梭 菌；否则判定为阴性，即不是艰难梭菌。

采用上述方案的有益效果是：

该方法步骤设置合理，利用合适的试剂以及培养条件抑制粪便中杂菌， 并提高艰难梭菌阳性培养率，保证鉴定结果的准确。

本发明所述的方法具有操作简单、所需时间短、鉴定结果的准确率高、 培养简易、阳性率高、污染少等优点，具有广阔的应用前景，尤其适用于医 院、科研单位艰难梭菌分离培养推广应用。

进一步，步骤1)中，酒精占混合体系的体积百分比为75％，硫磺胆酸 钠占混合体系的质量百分比为0.1％。

采用上述进一步方案的有益效果是：质量百分比为0.1％的硫酸胆酸钠 促进艰难梭菌芽孢生成，体积百分比为75％的酒精能够杀灭粪便样本中的 杂菌，而对艰难梭菌芽孢没有影响；同时混合质量百分比为0.1％的硫酸胆 酸钠与体积百分比为75％的酒精可以增强艰难梭菌芽孢生成，并且缩短处 理时间。

酒精浓度过高或过低不利于杀灭粪便样本中的杂菌；而硫磺胆酸钠浓度 过高或过低不利于艰难梭菌的芽孢形成与芽孢保护。

进一步，步骤2)中，静置的时间为1小时。

采用上述进一步方案的有益效果是：充分保证艰难梭菌芽孢生成与杀灭 粪便中的杂菌，并且不牺牲工作人员的工作效率。

进一步，步骤4)中，所述艰难梭菌选择培养基为CCFA选择培养基。

采用上述进一步方案的有益效果是：为艰难梭菌的常用选择培养基，有 利于艰难梭菌的生长，同时避免其他杂菌的过度生长。

进一步，步骤4)中，厌氧条件下培养条件为：30-37℃厌氧培养箱或厌 氧袋培养24h-48h。