[发明专利]速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种速效胰岛素前体蛋白、其编码基因、包含该编码基因的克隆载体或表达载体、转化体，以及利用该速效胰岛素前体蛋白制备速效胰岛素的方法。

背景技术

根据国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederation，IDF)的最新统计数据显示，2014年全球糖尿病患者人数已经高达3.87亿，按目前的增长速度，预测到2035年全球将有近5.92亿人患糖尿病。令人担忧的是，中国糖尿病患者更是高达9628.8万人，是全球糖尿病患者人数最多的国家。

包括门冬胰岛素、赖脯胰岛素在内的速效胰岛素属于第三代胰岛素，可用于成人I型糖尿病和II型糖尿病的治疗。门冬胰岛素还可用于儿童、青少年和孕妇及哺乳期妇女糖尿病的治疗。门冬胰岛素的问世，为拯救糖尿病患者的生命，提高患者的生活质量，带来了新的曙光。

门冬胰岛素是一种人胰岛素类似物，由A、B两条链组成，与人胰岛素不同的是其B链第28位脯氨酸替换为天门冬氨酸，利用电荷的排斥作用阻止了胰岛素单体的自我聚集，从而迅速吸收，因此起效比人胰岛素更快。因此，门冬胰岛素弥补了人胰岛素的不足，使外源性胰岛素能更好地满足餐时胰岛素需求，包括餐前注射吸收迅速、稳定，达峰时间短，从而更有效地控制餐后高血糖。

目前用重组DNA技术表达胰岛素及胰岛素类似物，主要有三种方法。第一种方法是利用大肠杆菌表达胞内融合蛋白，通过破壁收获包涵体，再经变复性、酶解方式等处理获得胰岛素或胰岛素类似物分子。大肠杆菌有生长迅速，培养成本低等优势，但是其缺点也非常明显：因为大肠杆菌表达的蛋白质大多数以包涵体形式存在，必须经过破壁、包涵体收集与变复性处理才能得到活性分子，但这些处理方法存在能耗大，工艺繁琐，收率不高等诸多缺点。

例如，美国专利US20140221606A1公布了一种肠杆菌制备速效胰岛素的方法，该方案在A链和B链之间添加了一段35个氨基酸残基的C肽，使速效胰岛素前体分子的表达能力提高至3～5g/L。但是该法通过大肠杆菌表达的速效胰岛素前体分子需经过破壁、包涵体的收集与洗涤、包涵体溶解、稀释复性、纯化、蛋白酶解等复杂过程才能获得完整的速效胰岛素分子，再经过一系列层析步骤获得纯品，其制备工艺十分复杂，产品收率不高。

第二种方法是利用酿酒酵母表达胰岛素或胰岛素类似物前体分子，使产物分泌到胞外培养基中，然后经捕获、酶解和转肽等方法制备胰岛素或胰岛素类似物分子。虽然酿酒酵母能够将蛋白质分泌到胞外，但也存在一些缺点：如酿酒酵母容易使表达产物发生高度糖基化，增加了人体发生免疫反应的风险，因此必须在药物纯化过程中增加步骤控制杂质含量。再者，酿酒酵母还存在生长缓慢，发酵密度不高，启动子能力较弱等问题，这些缺点导致产物表达量低。

例如，美国专利US5,618,913公布了诺和诺德公司制备门冬胰岛素的方法。该方法以酿酒酵母为表达宿主，利用重组DNA技术生产得到门冬胰岛素前体，再通过转肽等一系列复杂工艺制备门冬胰岛素。该方法技术壁垒高，特别在宿主菌改造、质粒构建等方面技术难度大、工艺复杂。由于酿酒酵母自身表达能力较弱，因此产物表达量不高，其工程菌摇床培养最高为21.5mg/L，一定程度上增加了药品生产成本。

第三种是利用毕赤酵母表达胰岛素或胰岛素类似物前体分子，表达产物同样分泌到胞外培养基中，经捕获、酶解和转肽等方法制备胰岛素或胰岛素类似物分子。毕赤酵母是一种非常优秀的表达系统，它可以将蛋白质直接分泌到胞外，还有发酵密度高，产量高等优势。

但是，目前使用毕赤酵母表达系统生产胰岛素的方案中仍然面临着表达量不高、产率偏低的挑战，原因涉及编码序列、纯化方法等多方面。因此，仍有必要提供一种能够以更高效率和得率生产胰岛素的系统和方法。

发明内容