[发明专利]速效胰岛素前体蛋白以及速效胰岛素的制备方法

权利要求书

1.一种门冬胰岛素前体，其氨基酸序列为：

Z₁(XY)_nZ₂Z₃Z₄-B(1-29)-C₁C₂C₃-A(1-21)，其中

Z₁、X、Z₂分别为Asp或Glu；Y为Ala或Gly；n为1~10之间的整数；Z₃为Pro、Glu或Asp；Z₄、C₃分别为Lys或Arg；C₁、C₂分别为Glu、Asp、Ala或Gly；B(1-29)为门冬胰岛素B链1-29位氨基酸；并且A(1-21)为门冬胰岛素A链1-21位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Z₁是Glu。

3.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中X是Glu。

4.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Y是Ala。

5.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Z₂是Glu。

6.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中Z₃是Pro。

7.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中C₁是Glu或Asp。

8.根据权利要求1所述的门冬胰岛素前体，其中C₂是Gly或Ala。

9.一种编码权利要求1所述的门冬胰岛素前体的核苷酸序列。

10.一种含有权利要求9所述的核苷酸序列的克隆载体。

11.根据权利要求10所述的克隆载体，所述克隆载体为重组质粒pPIC9K，重组质粒pPICZαA或重组质粒pPinkαHC。

12.一种包含权利要求10或11所述克隆载体的表达系统。

13.根据权利要求12所述的表达系统，其中一个所述表达系统含有1-12个拷贝的克隆载体。

14.根据权利要求12或13所述的表达系统，其中所述表达系统为毕赤酵母细胞。

15.根据权利要求14所述的表达系统，其中毕赤酵母细胞为毕赤酵母GS115、毕赤酵母X-33或毕赤酵母PichiaPink。

16.一种制备门冬胰岛素的方法，包括：

培养权利要求13所述的表达系统；

分离、富集得到门冬胰岛素前体；

用胰蛋白酶或赖氨酰内切酶进行转肽，获得门冬胰岛素粗品；以及

纯化获得门冬胰岛素。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤（a）之前，对权利要求13所述的表达系统进行筛选，以选择出表达水平最高的表达系统。