[发明专利]一种人TSCM细胞的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外扩增人外周血TSCM细胞的 方法及应用。

背景技术

近年来，随着免疫学技术的发展，非特异性免疫细胞治疗在临床上因为有一定的 效果，被越来越多的人接受。目前现有的免疫细胞治疗的有CIK、CTL等细胞，这些在体内存 活时间短，并且治疗效果随个体差异及制备手段的不同效果差异也很大。免疫细胞的自我 更新、维持稳态、杀瘤能力都会随着分化而减弱，最后变成终末分化细胞，呈现衰老等状态。 而市面上的CIK、CTL等细胞大多都趋近于终末分化细胞。TSCM细胞可以通过自我更新在体 内长期存在，维持自我稳态，并具有更强的杀瘤活性。

国外现有的TSCM培养方法培养细胞量较少，不能满足一次回输所需要的量。本方 法，通过使用细胞IL-7、IL-15维持体内干性细胞数量并且增强细胞毒性和记忆性，IM-12独 断GSK-3β信号并且增强Wnt信号通路是TSCM细胞增殖但是维持干性，降低其分化程度，提高 表达CD45RA的细胞的量，使这群细胞具有干细胞特性，维持稳态及自我更新能力，并具有更 强的杀瘤活性。而不仅仅是使用终末分化的CIK或者CTL细胞。并且TSCM细胞也是唯一一种 可以在器官移植中增殖并且调节移植物抗宿主病的T细胞亚群。

TSCM细胞可以突破现有过继性免疫的限制，解决T细胞的移植问题、在体内存活时 间短的问题、不能再持续产生免疫应答等的问题，具有更强的抗瘤效应。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种实用高效的体外扩增人TSCM细胞的方法。

本发明采用的技术方案是：一种制备人TSCM细胞的方法，包括如下步骤：采集并分 离外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs），用抗CD3单抗和抗 CD28单抗刺激，同时加入细胞因子rhIL-7、rhIL-15、rhIL-2及IM-12，置于37℃，5%CO₂和 饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半两更换培养并补加等量的rhIL-2、rhIL-7、rh IM-12及和IM-12，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加等量含有rhIL-2、rhIL-7、rh IL-15和IM-12的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2）×10⁶个/mL。10～15天即可获得TSCM 细胞。

根据本发明，所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离手机， 并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得。所述rhIL-7的终浓度为1-50ng/mL、rhIL-2终浓 度为50-1500IU、IM-12终浓度为1-50μM、抗CD3单抗终浓度为1-50ng/mL、抗CD28单抗终浓度 为5-300ng/mL。根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10-21天。

本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

本发明的有益效果：利用抗CD3单抗和抗CD28单抗作为刺激剂，激活TSCM细胞，并 联合细胞因子rhIL-7、rhIL-15和rhIL-2共同刺激，利用IM-12阻断干细胞分化培养TSCM 细胞，使获得的细胞具有记忆细胞和干细胞的共同特性。从而为临床过继性免疫细胞治疗 提供新的可选方案。

具体实施方式：

下面用实例说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实 验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1

本实例1是用rhIL-7、rhIL-15、rhIL-2、抗CD3单抗、抗CD28单抗刺激PBMCs，用IM-12 阻断干性细胞分化，以获得TSCM细胞。具体操作包括以下步骤：

1.无菌条件下用血细胞分离机或50mL注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡 糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆 层，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水按1:1稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液 与稀释血液按照1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，放置时间较长的血液离 心30分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤两次，转速分别为1500转/分，1200转/分，均离 心8分钟，即可获得外周血单个核细胞。