[发明专利]一种鉴定γδT细胞杀伤的方法在审

专利信息
申请号: 201511013848.9 申请日: 2015-12-31
公开(公告)号: CN105424582A 公开(公告)日: 2016-03-23
发明(设计)人: 饶秀茸;崔博靖;付凡;马飞;王宇环 申请(专利权)人: 深圳市合一康生物科技股份有限公司
主分类号: G01N15/14 分类号: G01N15/14
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 518000 广东省深圳市福田区福保*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 鉴定 细胞 杀伤 方法
【说明书】:

技术领域

发明是细胞免疫学技术领域,具体是运用流式细胞原理检测通过双标法标记Calcein-AM和PI染色的方法鉴定γδT细胞杀伤效率。

发明背景

T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(Tcellreceptor,TCR)的不同分为两类:RCRαβ细胞和TCRγδ细胞,其中γδT细胞是一个桥连接固有免疫和适应性免疫的独特的一群T淋巴细胞,γδT主要分布于皮肤和黏膜组织中,占外周淋巴细胞群的0.5-5%,这样一群细胞在机体抗感染和抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用,目前已经临床实验证实了γδT细胞在肿瘤的生物治疗中已经得到良好的治疗效果和广泛的应用,但是如何对体外扩增培养的的γδT细胞进行功能性的检测?本发明就针对这一项进行公开的阐述,免疫细胞杀伤实验的经典的检测方法是用51Cr释放法,但是由于51Cr是放射性物质,操作起来不方便等原因限制了这一个方法的广泛应用,而MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)释放法都存在灵敏度不高等原因也限制了其广泛应用,本发明就是运用calcein-AM和PI双标染色法结合流式细胞仪上检测免疫细胞杀伤效率。本方法优点是操作简单,准确,经济,快速,并能得到很好的稳定性。对于其他所有免疫细胞的功能性鉴定提供的十分重要的价值。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种简单快速检测γδT细胞的杀伤性功能的方法,通过流式细胞仪上可以快速检测出细胞的杀伤效率的方法,克服经典的51Cr的放射性物质的污染和MTT,LDH的方法的灵敏度低的限制条件。

本发明所采用的技术方案是:一种简单快速检测γδT细胞的杀伤性功能的方法,包括以下步骤:

(1)制备外周血单个核细胞:采取健康志愿者的外周血,肝素钠抗凝,应用淋巴细胞分离液进行密度梯度分离得到单个核细胞,用GT-T551培养基或者RPMI1640培养基重悬细胞。

(2)诱导培养γδT细胞:重悬好的细胞沉淀,取少量进行细胞计数,调整浓度在(1-2)X106/ml,加入磷酸抗原HMBPP20ng/ml和rhIL-2因子1000IU/ml对细胞诱导,放37OC,5%CO2培养箱培养至10-14天。

(3)Calcein-AM标记肿瘤细胞:取对数生长期的KA562细胞,PBS洗涤1次,无血清RPMI1640培养基重悬,计数后调整细胞密度在(1-2)X106/ml,加入钙黄绿素(Calcein-AM)0.1uM,37度染色30分钟;PBS洗涤2次,离心后用无血清培养基重悬,计数后调整浓度在4X105/ml,2X105/ml,1X105/ml,备用。

(4)与γδT细胞共培养:取第10天之后的γδT,PBS洗涤1次,用无血清RPMI1640培养基重悬,计数,调整浓度在2X106/ml;铺24孔板,K562和γδT分别加入0.5ml,使得终浓度为5:1,10:1,20:1,各孔分别设置3个复孔,另外设置空白对照孔,阳性对照孔各重复3个复孔,于37度培养箱共培养24小时后,收集细胞上流式细胞仪检测细胞杀伤效率。

(5)流式检测细胞杀伤效率:共培养后24小时收集细胞到1.5mlEPPENDORF管中,1500rpm离心5分钟,沉淀用100ulPBS重悬起来,加入PI(1mg/ml)2ul到100ul体系中,混匀,室温放置15分钟;上BDAccuriC6流式细胞仪检测γδT细胞对K562的杀伤效率,设定空白管γδT对照孔和K562阳性对照孔,对K562对照孔进行圈门,再打开另一窗口,FL-1和FL-2进行作图,可直观得到杀伤率Ratio=UR%

(6)根据本发明,所述的培养基为GT-T551免疫细胞专用培养基,RPMI-1640用于肿瘤细胞培养的培养基,Calcein-AM购于Invitrogen公司,碘化丙锭(PI)购于Sigma公司。流式细胞仪AccuriTMC6购于BD公司,Z2全自动细胞计数仪购于BeckmanCoulter公司。

本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外,均市售可得。

具体实施方式

下面用实例具体说明本发明,但是本发明并不受其限制。下面实例中凡为注明具体条件的实验方法,均为遵循常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1

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