[发明专利]一种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于微量元素检测技术领域，具体地，涉及一种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法。

背景技术

铜离子是生物体不可缺少的微量元素。在生物体内，铜主要是以与酶、蛋白质分子以及一些生物小分子如氨基酸络合的状态存在。铜离子参与生物体一些重要的生理过程，如细胞呼吸、神经递质的传递、抗氧化应激和铁离子的摄取都依赖于铜离子。人体许多疾病与体内铜离子失衡有关，如肝豆状核变性、疯牛病、阿尔兹海默症和癌症等。神经退行性疾病与铜蓝蛋白的丧失生物活性或Cu(Ⅰ)毒性有关。铜离子在生物体内发挥的作用主要是基于它氧化还原的化学性质，也就是Cu²⁺和Cu⁺氧化态之间的转换。细胞内的一些重要生物化学反应是由于两个氧化态之间的转换而得以进行。

目前生物体大多只能定量测定总铜，并不能区分Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)。生物体系μg/L级的痕量Cu(Ⅰ)离子测定国内外迄今没有文献报道。在Cu(Ⅱ)离子存在下，测定Cu(Ⅰ)铜离子面临着如何消除Cu(Ⅱ)离子的干扰问题。在纯化学体系中测定Cu(Ⅰ)离子时，Cu(Ⅰ)离子很容易被空气的氧所氧化，在无机溶液中很不稳定。但由于其能与联喹啉形成高强度双配位基Cu(Ⅰ)离子配合物，且在有机溶剂中能稳定存在，因此可用分光光度法测定。但对生物样本痕量的Cu(Ⅰ)离子仍然无法用分光光度法测定。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现。

一种液液萃取-GFAAS法测定一价铜含量的方法，包括如下步骤：

S1.标准工作曲线的制作：在惰性气体的保护下，将CuCl的标准品用饱和KCl溶液定容，得到1000ppm的亚铜标准溶液；取亚铜标准溶液与pH9的甘氨酸-NaOH缓冲溶液按体积比1:9混合，再向混合溶液中加入等体积的0.06%(w/w)2，2′-联喹啉的正戊醇溶液，混匀，静置分层，取上层有机层用2，2′-联喹啉的正戊醇溶液依次稀释成10、1、0.1、0.01ppm溶液，取0.01ppm溶液1mL上机，制作工作曲线；

S2.一价铜的检测：将样品与等体积20%的三氯乙酸混匀，根据样品含铜量，再与pH9的甘氨酸-NaOH缓冲溶液按不同比例稀释，再向混合溶液中加入1mL的0.06%(w/w)2，2′-联喹啉的正戊醇溶液，混匀，静置分层，取上层有机层，上机用石墨炉原子吸收法测定一价铜含量；

其中，S2所述样品为血清时，取样品的上清液用缓冲溶液稀释20倍；S2所述样品为细胞液、细胞膜液、组织液或尿液时，取样品的上清液用缓冲溶液稀释1倍；S2所述样品为不含蛋白的无机溶液时，直接将样品用缓冲溶液稀释1倍。

甘氨酸与Cu(Ⅱ)能形成稳定的无机络合物，其稳定常数为15.1，且在pH8-10范围，极易生成配位比1:2的稳定铜氨络合物，所形成的甘氨酸螯合铜不溶于有机溶剂，其中pH为9时最优。2,2′-亚铜试剂(2,2′-联喹啉)是测定Cu(Ⅰ)的特效试剂，与Cu(Ⅰ)形成的络合物能很好地溶解在有机溶剂而难溶于水。当含有甘氨酸的水溶液生物样本用含有2,2′-联喹啉的有机溶剂萃取时，就能将两者很好地分离在水相和有机相中，从而达到将两种离子分离而达到分别测定的目的。分离后的有机相用石墨炉原子吸收测定Cu(Ⅰ)，就能大大提高测定Cu(Ⅰ)的灵敏度。

优选地，S2所述样品为含蛋白的样品时，将样品与三氯乙酸混匀后离心去蛋白，再取去蛋白后的上清液进行后续步骤。含蛋白质的样品包括血清、细胞液、细胞膜液、组织液。不含蛋白的无机溶液或其他生物体液如尿液，可减少去蛋白步骤。优选地，所述不含蛋白的无机溶液包括矿泉水、自来水。

优选地，所述离心为1200rpm离心10min。

优选地，S2所述样品为细胞液、细胞膜液或组织液时，另取未去蛋白前的样品测定蛋白浓度，以蛋白含量定量一价铜浓度。S2所述样品为细胞液、细胞膜液或组织液时，因细胞无法定量体积，故须另取未去蛋白前的样品测定蛋白浓度，用同体积的样本含铜量除以含蛋白量，即每克蛋白所含的亚铜质量定量一价铜浓度。

优选地，S2所述样品来自细胞时，将样品进行如下预处理：培养数天后的细胞收集，超声或冰冻破碎后，分离得到的上清即细胞液，沉淀下来的细胞膜用适量表面活性剂溶解，再作为样品进行测定。

优选地，S1、S2所述混匀的方法为旋涡振荡1min。