[发明专利]单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活 疫苗及其制备方法。

背景技术

单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirus，HSV）是一种以人类为唯一自然宿主的双 链包膜DNA病毒，血清学分为HSV-Ⅰ和HSV-2型。HSV-Ⅰ主要感染口、眼、唇的皮肤和粘膜、中 枢神经系统以及外生殖器造成龈口炎、唇疱疹、角膜结膜炎、疱疹性脑炎、脑膜炎、生殖器疱 疹等疾病；HSV-2主要引起生殖器疱疹；疱疹病毒严重威胁着人类健康。目前，临床上常使用 疱疹净、阿糖腺苷、无环鸟苷、泛洛昔韦等抗毒药物治疗，虽能缓解临床症状，但不能彻底清 除潜伏于体内的病毒，且存在药物毒副作用大、易出现耐药、容易复发等缺点。HSV感染性疾 病常反复发作，迁延难愈，给病人造成极大痛苦，HSV疫苗的研究开发为预防和治愈HSV感染 性疾病带来了希望。

病毒疫苗可分为传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗 和亚单位疫苗；新型疫苗是指利用基因工程技术构建的如基因缺失活疫苗、载体疫苗、病毒 样颗粒疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等，其在多种病毒感染性疾病的治疗中得到广泛应用并 取得较好的疗效。减毒活疫苗基本包含病毒全部或大部分抗原，并具有和野生型病毒相同 的感染及复制特性，基本无致病性，故减毒后的活疫苗可以有效地诱导机体免疫应答，相对 于其它种类的疫苗而言，免疫原性强，保护效果好，在人类抵抗感染性疾病的历史上发挥了 不可替代的作用。

中国专利申请201010253601.5公开了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其 制备方法，该减毒活疫苗敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组中的UL43、UL44、UL45、UL46和UL47 基因。该减毒活疫苗是敲除了其基因组中的复制或感染非必需基因片段，能够诱导机体的 免疫应答系统，及时清除感染的病毒，抑制感染的进一步发展，但其制备方法有诸多不足之 处：（1）选取拟敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源侧翼序列和荧光蛋白基因组 成同源重组框，由于目的片段太长使PCR扩增困难；（2）选择pShuttle-CMV载体，同源重组框 整合到拟敲除基因的正确位置效率偏低，成功机率不大；（3）用荧光蛋白基因代替拟敲除病 毒基因用于筛选鉴定，虽然此方法快速、简便，但最终未能将荧光蛋白基因去除，构建的减 毒活疫苗仍表达该蛋白。

因此，现有技术存在减毒活疫苗的制备方法复杂、成功效率偏低等缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒 活疫苗，通过敲除特定基因制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等 优点，可有效防治HSV-1的感染。

本发明提供一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，包含单纯疱疹病毒Ⅰ型基 因敲除型病毒株，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、 UL40、UL41、US8、ICP8、ICP34.51和ICP34.52基因中的至少一个。

优选地，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、UL41 和US8中的至少一个。

优选地，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的US8基因。

相应地，本发明还提供单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，包括如 下步骤：

S1、BAC-HSV-1宿主菌的构建：扩大培养HSV-1病毒，提取HSV-1基因组，并与BAC质粒重 组，构建得到BAC-HSV-1重组质粒，BAC-HSV-1重组质粒电转化至宿主菌，得到BAC-HSV-1宿 主菌；

S2、BAC基因敲除系统的构建：将I-SceI插入到pREDI载体上，并将构建的pREDI重组质 粒电转化至S1构建的BAC-HSV-1宿主菌，得到BAC基因敲除系统；

S3、同源重组片段替代拟敲除基因：以Kam-SacB全片段为模板，PCR扩增拟敲除基因的 同源重组框，先进行第一次PCR扩增，再以第一次PCR扩增产物为模板进行第二次PCR扩增， 得到同源重组片段，电转化至S2构建的BAC基因敲除系统中进行第一次同源重组，由抗性基 因和SacB基因共同取代BAC-HSV-1中的拟敲除基因；Kam-SacB全片段通过现有常规技术手 段构建得到；