[发明专利]单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，其特征在于：包含单纯疱疹病毒Ⅰ型基 因敲除型病毒株，所述基因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、 UL40、UL41、US8、ICP8、ICP34.51和ICP34.52基因中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，其特征在于：所述基 因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的UL5、UL18、UL41和US8中的至少一个。

3.根据权利要求2所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗，其特征在于：所述基 因敲除型病毒株敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组的US8基因。

4.根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在 于：包括如下步骤：

S1、BAC-HSV-1宿主菌的构建：扩大培养HSV-1病毒，提取HSV-1基因组，并与BAC质粒重 组，构建得到BAC-HSV-1重组质粒，BAC-HSV-1重组质粒电转化至宿主菌，得到BAC-HSV-1宿 主菌；

S2、BAC基因敲除系统的构建：将I-SceI插入到pREDI载体上，并将构建的pREDI重组质 粒电转化至S1构建的BAC-HSV-1宿主菌，得到BAC基因敲除系统；

S3、同源重组片段替代拟敲除基因：以Kam-SacB全片段为模板，PCR扩增拟敲除基因的 同源重组框，先进行第一次PCR扩增，再以第一次PCR扩增产物为模板进行第二次PCR扩增， 得到同源重组片段，电转化至S2构建的BAC基因敲除系统中进行第一次同源重组，由抗性基 因和SacB基因共同取代BAC-HSV-1中的拟敲除基因；

S4、基因敲除病毒株的筛选：抗性基因筛选同源重组成功菌，鼠李糖诱导I-SceI内切酶 合成，切除抗性基因和SacB基因，发生第二次同源重组，得到含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除 病毒株基因的宿主菌；扩大培养得到的含单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株基因的宿主菌， 提取△BAC-HSV-1质粒，并将该△BAC-HSV-1质粒电转至宿主细胞中，形成单纯疱疹病毒Ⅰ型 基因敲除病毒株；

S5、将S4得到的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株进行空斑纯化，得到单纯疱疹病毒Ⅰ 型基因重组减毒活疫苗。

5.根据权利要求4所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在 于：

所述同源重组框包括拟敲除基因上下游各50bp同源序列、抗性基因和SacB基因。

6.根据权利要求5所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在 于：所述拟敲除基因为UL5，其同源重组框构建的第一次PCR的上游引物为 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA，下游引 物为GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC；第 二次PCR的上游引物为GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCG CACCACGCTCGC，下游引物为GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCA TCTTGCAAGAATGGCGC。