[发明专利]一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法。本发明涉及基因间共表达调控序列、DNA重组和质粒转化等基因工程学，以及通过基因工程学方法重组多基因共表达质粒及其用途，包括一种含有Cre-er融合基因序列、SV40LT基因序列、hTERT基因序列、NeoR基因序列、EGFP-TK融合基因序列以及人工设计并合成含有四个FMDV-2A自剪肽的多克隆位点序列的质粒型逆转录病毒载体和该质粒型逆转录病毒载体的构建方法。

背景技术

研究一种物质或某个基因是否参与了脂肪组织的成脂定型、成脂分化或脂质代谢的调节作用，至少要观察前脂肪细胞或脂肪细胞是否对该处理因素有响应。关于猪脂肪发育、脂肪沉积，尤其是肌内脂肪的沉积，到目前为止还没有系统的研究，这主要是由于缺少来源于猪脂肪组织合适的脂肪细胞系，它们需具有来源于健康活体的正常脂肪细胞且能够在体外长期培养以便于进行实验。然而，利用现有方法分离的原代细胞寿命有限，往往仅能有限的传代几次便进入衰老状态，此外，每次获取原代细胞用于实验的过程不仅费时费力，还受到科研资金和动物福利的限制。同时，由于猪的个体差异、取样分离细胞技术的差异和细胞衰老状态的差异等等诸如此类的差异使得这方面的研究不能广泛的推广。上述的限制因素均使得大规模的研究猪脂肪沉积机理的进程受到了阻碍。本发明，一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法为上述问题带来了转机。

国外文献报道，猿猴病毒大T抗原基因(SV40LT)和人端粒酶基因(hTERT)不仅可以加快细胞的生长速率，增加细胞的传代次数，也可以使细胞转化为永生化细胞系。然而，SV40LT处理的细胞虽然度过了衰老期(MⅠ期)，但多数细胞最终会进入危机期(MⅡ期)而死亡。此时，细胞染色体异常，细胞的分裂逐渐减少，细胞死亡率增加。同时，SV40病毒也具有致瘤性，而hTERT处理的细胞基本能保持染色体稳定、分化正常和无致瘤性等特点，hTERT可以维持细胞染色体端粒的稳定，使细胞度过MⅡ期，从而继续存活。因此，本发明，一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体将SV40LT和hTERT用FMDV-2a自剪肽串联表达，不仅避免了共转两个质粒时表达效率的偏差，也使得最终获得的细胞既能够度过MⅠ期，又能够度过MⅡ期，为真正获得寿命更长、更稳定的细胞系提供了一个可实现的基础、路径和技术支持。

通常情况下，永生化细胞系是利用重组病毒或逆转录病毒进行制备，用此类方法产生的永生化细胞系虽说可增加原代细胞体外扩增的能力，但转化的细胞有时会在细胞的表型及功能上可能和所来源的原代细胞有所差别，甚至表现出不同的代谢方式，原有的分化特性退化等问题。因此，将病毒转化的细胞系替代原代细胞的作为模式模型细胞进行研究存在潜在的风险性。为了解决这一问题，同时为了生物安全性的考量，我们在所构建的质粒型逆转录病毒载体中引入了Cre-LoxP重组酶系统，构建了一种用于细胞可回复性永生化的多顺反子载体。

Cre重组酶在1981年从P1噬菌体中发现，它具有能识别特异的DNA序列的特性，即识别LoxP位点，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。借助Cre-LoxP重组酶技术我们构建了含永生化基因SV40LT和hTERT的可回复性永生化的多顺反子载体，该多顺反子载体可以用于原代细胞的转染，使原代细胞发生永生化，便于细胞的大量增殖、传代及保存，并且在实验过程中，当需要将细胞用于正常生理或遗传实验时，可以利用位点特异性重组酶Cre识别特异性位点LoxP，切除位于两个同向LoxP序列之间的外源基因，使细胞回复到永生化之前的状态。在解决了原代细胞体外增殖传代问题的同时，又克服了永生化细胞恶性转变，细胞安全性差和表型功能偏差的难题。

鉴于Cre-LoxP重组酶系统重组效率的问题，为最终获得纯粹的回复细胞，我们引入了自杀基因清除未发生重组的细胞。胸苷激酶(TK)对更昔洛韦敏感，当在培养基中添加更昔洛韦时可清除少数未发生Cre-LoxP重组的未回复细胞，而回复的细胞由于TK基因被切除使得其对更昔洛韦耐药而不受影响，从而获得完全的回复细胞。