[发明专利]一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法

权利要求书

1.一种质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：该载体包含有五个如SEQIDNO：1-5所示核苷酸序列的多顺反子基因以及一个逆转录病毒系统；

SEQIDNO：1所示核苷酸序列的融合雌激素受体的重组酶Cre-er基因；

SEQIDNO：2所示核苷酸序列的猿猴病毒大T抗原SV40LT基因；

SEQIDNO：3所示核苷酸序列的人端粒酶hTERT基因；

SEQIDNO：4所示核苷酸序列的新霉素耐药NeoR基因；和

SEQIDNO：5所示核苷酸序列的融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白EGFP-TK基因；

其中：所述的逆转录病毒系统为一种口蹄疫病毒自剪肽FMDV-2A的短肽，其核苷酸序列如SEQIDNO：6-9所示。

2.如权利要求1所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的五个插入基因由四个自剪肽连接而成，这四个自剪肽的核苷酸序列不同，但编码蛋白的氨基酸序列是相同的。

3.如权利要求1或2或3所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：连接4个自剪肽的多克隆酶切位点如图16所示，依次为：NheI、MssI、AscI、SmiI、MreI、Eco72I、MauBI、SalI和Bst1107I，所述的酶切位点的顺序按平末端与粘性末端酶切位点交替排列，保证插入基因的方向与基因表达的方向相一致。

4.如权利要求1-4任一项权利要求所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：如图13所示的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的第二个Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列MoMuLV_LTR内包含一个噬菌体P1重组位点LoxP，所述LoxP的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。

5.一种质粒型逆转录病毒载体pCSHNET的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)将如图2所示的起始质粒pCTGTKlox的第二个ClaⅠ酶切位点利用定点突变方法突变成Bst1107Ⅰ酶切位点获得中间质粒pCB；

(2)人工合成含有四个口蹄疫病毒自剪肽的多克隆位点序列，每个自剪肽的核苷酸序列如SEQIDNO：6-9所示；

(3)用含酶切位点的引物分别扩增Cre-er基因和hTERT基因片段，使Cre-er基因序列的5’端含有EcoRⅠ酶切位点，3’端依次含有NheⅠ和Bst1107Ⅰ酶切位点，使hTERT基因的5’端含有SmiⅠ酶切位点，3’端含有MreⅠ酶切位点；

(4)将步骤(1)中获得的中间质粒pCB和步骤(3)中Cre-er扩增片段分别用限制性内切酶EcoRⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和Cre-er融合基因片段用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCB-Cre-er；

(5)将步骤(4)中获得的中间质粒pCB-Cre-er和步骤(2)中获得的自剪肽的多克隆位点序列分别用限制性内切酶NheⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和自剪肽片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-MCS；

(6)利用PCR扩增SV40LT基因序列，使其5’端上含有MssⅠ酶切位点，3’端上含有AscⅠ酶切位点；扩增NeoR基因序列，使其5’端含有Eco72Ⅰ酶切位点，3’端含有MauBⅠ酶切位点；扩增EGFP-TK融合基因序列，使其5’端含有SalⅠ酶切位点，3’端含有Bst1107Ⅰ酶切位点，将扩增的三个基因片段分别连接如图14所示的载体pMD-18T，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，分别得到中间质粒pMD-18T-SV40LT、pMD-18T-NeoR和pMD-18T-EGFP-TK；

(7)将步骤(5)中获得的中间质粒pCre-er-MCS和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-NeoR分别用限制性内切酶Eco72Ⅰ和MauBⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和NeoR片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-NeoR；

(8)将步骤(7)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-EGFP-TK分别用限制性内切酶SalⅠ和Bst1107Ⅰ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和EGFP-TK融合基因片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK；

(9)将步骤(8)中获得的中间质粒pCre-er-NeoR-EGFP-TK和步骤(6)中获得的中间质粒pMD-18T-SV40LT分别用限制性内切酶MssⅠ和AscⅠ双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和SV40LT片段利用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到重组质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK；

(10)将步骤(9)中获得的中间质粒pCre-er-SV40LT-NeoR-EGFP-TK和步骤(3)所得的hTERT基因片段分别用限制性内切酶SmilⅠ和MreⅠ进行双酶切，将酶切后的骨架质粒片段和hTERT基因片段用T4DNALigase进行连接反应，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，得到最终的重组质粒型逆转录病毒载体pCre-er-SV40LT-hTERT-NeoR-EGFP-TK-Lox，即为一种细胞回复性永生化的多顺反子载体pCSHNET。

6.权利要求1所述的质粒型逆转录病毒载体pCSHNET在制备猪源脂肪细胞系中的应用。