[发明专利]猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用，其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。

猪瘟病毒(Hogcholeravirus,Swinefevervirus)是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。猪瘟病毒主要危害猪(包括野猪)，其他动物不发病。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。猪瘟病毒兔化疫苗株是使用猪瘟病毒强毒株反复感染钝感动物家兔，通过传代使其毒力减弱而获得适应兔体的毒株，由此制成的疫苗。猪瘟病毒兔化疫苗株已被广泛应用于各国的养猪产业，为控制猪瘟起到了重要的作用。但同时，如何区分感染猪瘟病毒的猪和接种了兔化疫苗株的猪也成了行业内一大难题。传统的猪瘟病毒检测方法是病毒毒分离培养和ELISA为代表的血清学的检测，但在检测猪瘟野毒株和疫苗株时，检测结果毫无差别。基因检测可以作为区分野毒株和疫苗株的方案。现今广泛使用的方案是对猪瘟病毒基因组5’UTR区域进行序列分析，5’UTR兔化疫苗株和野毒株碱基序列分别为：

5’UTR兔化疫苗株：GGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGC；

5’UTR野毒株：GGACTAGCAAACGGAGGGACTAGC；

5’UTR兔化疫苗株比野毒株多一个碱基A，在设计引物对5’UTR区域进行扩增后通过序列分析可以有效的区分野毒株和疫苗株。

现有区分野毒株和疫苗株猪瘟病毒的方法通常有一下几种：

1)PCR-测序：设计引物将猪瘟病毒5’UTR区域进行PCR扩增，并将产物进行测序，从而区分；

2)PCR-溶解曲线分析：使用荧光染料法(SYBRgreen)对猪瘟病毒5’UTR区域进行Real-timePCR扩增检测，实时荧光PCR结果呈阳性后对产物进行溶解曲线分析，根据解链温度的不同来区分野毒株和疫苗株；

3)PCR-Taqman探针法：根据突变区域，设计两条不同标记的Taqmen探针，分别和野毒株、疫苗株完全互补，然后优化荧光PCR体系分辨率至足以区分野毒株和疫苗株。

然而，PCR-测序法操作步骤繁琐，成本高，很难作为常规检测使用；PCR-溶解曲线法分辨率低，单碱基突变再溶解曲线结果上判断偏主观，而且对仪器要求较高，市面上大部分仪器不适用；PCR-Taqman探针法对扩增体系的分辨率优化要求较高，且当样本浓度较低时，对结果的判断也偏主观。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，旨在解决现有技术不能高效、准确区分野毒株和疫苗株猪瘟病毒的问题。

本发明的另一目的在于提供一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法。

本发明是这样实现的，一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针；

所述猪瘟病毒5’UTR引物包括：

猪瘟病毒5’UTR上游引物：5’-GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3’；

猪瘟病毒5’UTR下游引物：5’-TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’；

所述DNA/RNA杂合探针包括：

所述野毒株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTGC-3’；

所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTTGC-3’。

以及，一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法，该方法使用上述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：

样本RNA提取；

RT-PCR一步法检测；

结果判断；

其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：

42-50℃：10-15min；