[发明专利]一种高荧光强度的重组藻胆蛋白串联体的制备方法

说明书

本发明属于生物技术中荧光蛋白质领域，具体的说是一种高荧光强度的重组藻胆蛋白串联体的制备方法。将链霉亲和素基因与别藻蓝蛋白α亚基基因，通过linker序列连接起来。在此基础上，再通过linker序列实现一个或多个别藻蓝蛋白α亚基基因的串联，形成融合基因。将该融合基因与藻胆蛋白裂合酶基因和藻红胆素生物合成酶基因在大肠杆菌中共表达，获得具有生物素结合能力的、荧光强度更高的重组别藻蓝蛋白串联体。在免疫荧光检测中，重组藻胆蛋白串联体得到比重组藻胆蛋白单体更强的荧光信号。本发明中制备的重组藻胆蛋白串联体，可作为生物学和生物医学领域中免疫荧光检测的荧光标记物。

技术领域

本发明属于生物技术中荧光蛋白质重组表达制备领域，具体的说是涉及高荧光强度的重组藻胆蛋白串联体的制备方法。

背景技术

藻胆蛋白是藻类重要的色素蛋白，具有光能捕获和传递的作用。每分子的藻胆蛋白含有两条结构相似的多肽链α和β，α亚基和β亚基分别含有约160～180个氨基酸残基，二者的比例通常为1:1。亚基中的半胱氨酸残基通过硫醚键与藻胆色素共价结合，藻胆色素的种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定了藻胆蛋白的光谱学性质。根据吸收光谱的不同，可将藻胆蛋白分为4大类：即藻红蛋白PE,λ_max＝540nm～570nm，藻红蓝蛋白PEC，λ_max＝567nm，藻蓝蛋白PC，λ_max＝615nm～640nm和别藻蓝蛋白APC，λ_max＝650nm～655nm。

藻胆蛋白能发出强烈的荧光，其荧光特性最重要的用途是在免疫诊断用荧光标记、生物医学研究等方面，可将其与生物素、亲和素或各种抗体结合制成荧光探针，用于免疫荧光分析和检测等工作中。在免疫荧光分析中，藻胆蛋白作为荧光标记物需要与抗体结合，即通过双功能试剂将藻胆蛋白分子与抗体分子共价交联，或藻胆蛋白通过交联剂与链霉亲和素交联后，在通过生物素·亲和素系统(BAS)将藻胆蛋白分子间接耦联到抗体分子上。

文献“Functional biosynthesis of an allophycocyan beta subunit inEscherichia coli，Journal of Bioscience and Bioengineering，107(3),246–249,2009”报道了一种利用基因工程方法生产重组别藻蓝蛋白的方法，但是该重组别藻蓝蛋白为单亚基，共价结合的藻蓝胆素，荧光量子效率低，因而荧光强度较低。中国专利“结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，专利授权号：200810025626.2”，提供了一种基因工程方法生产结合藻红胆素的重组别藻蓝蛋白的方法，由于重组蛋白也是单亚基，荧光强度的提升有限。

本发明提供一种具有生物素结合能力的重组藻胆蛋白亚基串联体的制备方法。相对于重组藻胆蛋白亚基单体，串联体蛋白具有更高的荧光强度，在生物学和生物医学等领域中，对抗原的免疫荧光检测中将具有较好的应用前景。

发明内容

本发明目的在于提供高荧光强度的重组藻胆蛋白串联体的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高荧光强度的重组藻胆蛋白串联体的制备方法，其特征在于：将链霉亲和素基因与别藻蓝蛋白α亚基基因，通过Linker序列连接起来。在此基础上，再通过linker序列实现一个或多个别藻蓝蛋白α亚基基因的串联，形成融合基因。将该融合基因、藻胆蛋白裂合酶基因和藻红胆素生物合成酶基因在大肠杆菌中共表达，获得共价结合藻红胆素的具有更高荧光强度的重组别藻蓝蛋白串联体。

具体是：

1)将链霉亲和素基因和别藻蓝蛋白α亚基基因通过linker序列连接形成融合基因，在此基础上，再通过linker序列连接一个或多个别藻蓝蛋白α亚基基因。

将该融合基因插入到大肠杆菌表达载体pCDFDuet-1的表达框中；将裂合酶基因cpcS插入到该表达载体的另一个表达框中；