[发明专利]聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂

说明书

本发明提供一种治疗由人体内血尿酸升高而引起的各种疾病的聚乙二醇化重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂，其特征在于由以下成分组成：为活性成分的聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶、在冷冻或冻干过程种保持蛋白活性和稳定的的冻干保护剂、填充剂、酸碱调节剂和维持一定pH值条件的缓冲液。其特点是保持聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干后完整的空间构型和生物学活性，不仅有利于药物的保存，而且有利于药物在短时间内重溶并且复性。

技术领域

本发明涉及新的生物制品冻干制剂、制备方法及在相关治疗领域的应用，具体地说，本发明涉及给予由人体内血尿酸升高而引起的各种疾病的聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂。

背景技术

尿酸是鸟类、爬行类和包括人在内的灵长类动物体内嘌呤代谢的终产物，因为在这些动物体内缺乏以分子氧为受体催化尿酸进一步分解为尿囊素、二氧化碳和双氧水的尿酸氧化酶。尿酸作为人体嘌呤代谢的终产物经肾脏排泄，当尿酸生成超过肾脏代谢时，例如富嘌呤食物摄入过多以及白血病和淋巴瘤及其化疗过程所引起的嘌呤代谢增加或者当肾脏处理病理状态时使正常产生的尿酸排泄受阻，这两种状况都会造成血浆尿酸显著升高，形成高尿酸血症。由于尿素及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性就使得高尿酸血症会引发或加剧很多疾病，例如：持续高尿酸血症时尿酸结晶沉积在外周关节、滑膜引起的急性炎症和疼痛是痛风的主要病因；尿酸不仅可以刺激血管平滑肌细胞增殖，而且还导致内皮细胞功能障碍；血浆高尿酸也是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素；尿酸沉积在肾脏组织，是引发急性肾衰、肾小管损伤、IgA肾炎的主要原因。

降尿酸的经典方案是用别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物降低尿酸生成，或用丙磺舒、苯溴马龙等药物促进尿酸排泄。黄嘌呤的水溶性低于尿酸，其积累有潜在的危险，黄嘌呤氧化酶抑制剂在初始尿酸浓度太高时疗效很差，还能引发超敏综合征，表现为发热、毒性上皮细胞坏死溶解、肝炎和嗜酸细胞增高，死亡率达20％，另外这类药和丙磺舒、苯溴马龙等促尿酸排泄类药都有明显肝肾毒性。因此，经典的降尿酸治疗策略不够安全而且疗效也不够理想。尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄能力使尿酸氧化酶成为治疗高尿酸血症及其继发症的理想药物：临床研究表明尿酸氧化酶可快速高效降低血清尿酸，且几乎没有毒副作用；在治疗肿瘤裂解综合征时，尿酸氧化酶比别嘌呤醇更安全有效；用于治疗痛风，能快速分解关节处沉积的尿酸从而消除引发的炎症和皮肤损伤。

尿酸氧化酶是一种新型的降尿酸药物，它以促进尿酸分解为药物特征。其中一种重组黄曲霉尿酸氧化酶(商品名：拉布立酶)被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤溶解综合征。但是尿酸氧化酶又是一种外源蛋白，直接或重复使用易引发抗体降低疗效，而且易过敏，需静脉注射，仅适于短期使用以降低尿酸(如使用拉布立酶治疗时间不能超过一个月)。所以对于长期治疗，显然需要长效且无免疫原性的尿酸氧化酶制剂，聚乙二醇化重组尿酸氧化酶能够解决应用天然酶时遇到的这些问题。

本发明申请人制备的聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶是从产朊假丝酵母中提取基因组DNA，通过PCR扩增，设计特定的引物，从产朊假丝酵母基因组中分离尿酸氧化酶基因，并将其插入到大肠杆菌表达质粒中，得到重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶转化子，再将重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶转化子转化入大肠杆菌中，得到可高效表达尿酸氧化酶的大肠杆菌工程菌株。再经过发酵培养，收获表达重组重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶的菌体，在经过菌体裂解、柱层析纯化得到纯化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶(详见发明专利ZL02819387.3)。纯化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶经特定的聚乙二醇修饰，修饰后经超滤或柱层析方法进一步纯化，得到聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶。

众所周知早期的对尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰会引起尿酸氧化酶蛋白特异性活性的大大降低，仅能保持修饰前蛋白的30％-50％的活力。本发明选用的PEG连接基团修饰后不影尿酸氧化酶特异性的酶活力。