[发明专利]一种磁性壳聚糖微球固定化黄嘌呤氧化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，具体涉及一种磁性壳聚糖微球固定化 黄嘌呤氧化酶的制备方法。

背景技术

磁性材料是一种用途广泛，历史悠久的功能材料。早在3000年 以前，古人便将天然磁铁作为指南针使用，在现代，磁性材料被用作 永磁马达、磁软盘、变压器中的铁心材料，作为存储器使用的磁光盘， 计算机用磁记录软盘等等。磁性壳聚糖微球作为高分子材料与磁性材 料的复合物，一方面有着优良的超顺磁性，使其很容易在外加磁场下 实现对靶向物质的富集、分离和回收利用；另一方面，又可通过活化 修饰引入如醛基、羧基、环氧基等的功能性基团而使其具有更多的功 能特性。这些性质使磁性壳聚糖微球具有标记、固定、引导和磁分离 的功能，从而在酶工程、细胞生物学、分离工程、分子生物学等领域 有着良好的发展前景。

近年来，关于磁性壳聚糖微球制备及其应用的研究越来越广泛， 尤其是在固定化酶方面。例如研究发现利用磁性壳聚糖磁性微球，用 于固定化血红密孔菌漆酶(BiochemicalEngineeringJournal,2005, 25(1):15-23)、脂肪酶(BiomassandBioenergy,2012,36:373-80)及 纤维素酶(华南理工大学2012年硕士学位论文)，可使酶的热稳定性、 pH稳定性、操作稳定性、储存稳定性以及酶的工作效率等得到很大 程度的改善。

黄嘌呤氧化酶/脱氢酶广泛存在于植物(小麦、豌豆苗、拟南芥 等)、动物(牛奶、小鼠乳腺及肝脏等)及微生物(节杆菌、链霉菌、 光合细菌等)中，是一种含钼、无机硫化物、非血红素铁的黄素酶， 能够催化次黄嘌呤、黄嘌呤生成尿酸，直接调控着体内尿酸水平的高 低，是体内嘌呤代谢的关键酶。黄嘌呤氧化酶作为一种重要的代谢调 控酶，在医学诊断及工业应用中具有远大前景，但游离酶较差的稳定 性直接影响其应用。

国内外关于黄嘌呤氧化酶稳定性的研究主要集中于改变溶液环 境提高其稳定性，对固定化方法的研究较少。张玉然等用修饰的琼脂 糖介质及大孔阴离子交换树脂固定化黄嘌呤氧化酶，发现以谷氨酸为 连接臂的琼脂糖介质(Sepharose-Glu)固定化效果最佳，酶活回收率 达到15.5％(食品与生物技术学报,2014,33(1):16-21)。陈国南等研 究以黄嘌呤氧化酶修饰的电加热碳糊电极，发现电极的电化学发光强 度与次黄嘌呤的浓度呈线性关系，另外，不同于一般的温敏电极，该 电极的温度是可控的(AnalyticalChemistry,2008,80(8):2826-2831)。 RafaelRadi等将黄嘌呤氧化酶固定在由锂皂石纳米颗粒构成的玻碳 电极上进行电化学研究，所制备的固定化酶不仅保留其生物活性，而 且显示良好的电化学性能(BiosensorsandBioelectronics,2009,24(12): 3556-3561)。

专利公开号为CN1368552A的专利公开了“一种可见光交联复合 树脂固定黄嘌呤氧化酶活性细胞的方法”，公开日期为2002年9月 11日，申请人为武汉大学。该方法以可见光交联复合树脂作为载体， 将黄嘌呤氧化酶活性细胞包埋于其中，经可见光照射，制备了固定化 细胞。制备的固定化细胞具有抗微生物分解性能好，机械强度高，化 学性能稳定，重复反应稳定性高，酶活保留高等方面的优点。

专利公开号为CN1834241A的专利公开了“一种固定化黄嘌呤氧 化酶及其制备方法和用途”，公开日期为2006年9月20日，申请人 为武汉大学。方法如下：将碳纳米管开管氧化，用水洗涤至中性并烘 干，将烘干后的碳纳米管和双十六烷基磷酸加入蒸馏水中，超声分散 得分散液；将分散液涂附在基体上，烘干，得到混合膜；将混合膜放 入黄嘌呤氧化酶溶液吸附，得到固定化黄嘌呤氧化酶。该专利的突出 特点是能同时得到黄嘌呤氧化酶三对氧化还原中心的电化学信号，并 且黄嘌呤氧化酶保持其生物活性，能催化其底物-硝酸根的还原，有 较好的稳定性和重现性。

专利公开号为CN103558306A的专利公开了“一种筛选黄嘌呤氧 化酶抑制剂的复合物及其应用方法”，公开日期为2014年2月5日， 申请人为中南大学。该专利通过戊二醛作为交联剂，将黄嘌呤氧化酶 固定在氨基化的四氧化三铁纳米粒子表面，得到黄嘌呤氧化酶修饰的 磁性纳米四氧化三铁粒子，用于快速筛选中草药中抑制黄嘌呤氧化酶 的活性物质。