[发明专利]一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程菌技术领域，尤其是通过对微生物利用糖类发酵合成尸胺的代谢途径中的关键调控位点进行改造，从而有效提高尸胺的产量的一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法。

背景技术

尸胺(Cadaverine)是一种多胺，即1,5-戊二胺(简称戊二胺)，在生物体内由赖氨酸脱羧生成，是广泛存在于生物体中的具有生物活性的含氮碱，但也作为一种肉毒胺存在于腐败物中。尸胺是合成新型材料聚酰胺-54(由尸胺和琥珀酸缩合而成)和聚酰胺-56(由尸胺和乙二酸缩合而成)的重要原料，具有重要的工业用途。

目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻、污染环境，酶转化法过程复杂、成本较高。利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和热点。

微生物发酵法生产尸胺就是微生物利用糖类进行发酵，通过代谢直接大量合成尸胺，这种方法简单、经济、环保和高效。虽然大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等可以直接合成尸胺，也对尸胺合成调节进行了广泛研究，但尸胺的产量有待提高。

JP2002223770和一些论文表明通过将赖氨酸脱羧酶基因和/或赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因cadB引入到谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌来提高尸胺生产。CN200780006903.9公开了尸胺合成途径中的一系列基因的敲除、抑制或增强，但是这些文献和专利都没有发现敲除或弱化赖氨酸转运蛋白基因lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi可以有效提高尸胺的产量。

因此，通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过发现新的能提高微生物发酵糖类生产尸胺的调控位点，并改变这些位点基因的表达方式来提高尸胺产量的一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种提高微生物利用糖类发酵生产尸胺的方法，通过对微生物合成尸胺的代谢途径中的关键调控位点进行改造。

而且，所述关键调控位点为赖氨酸转运蛋白基因lysE位点和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi位点，或者调控上述关键调控位点基因表达的这两个基因的调控位点。

而且，敲除赖氨酸转运蛋白基因lysE和/或6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，和/或者，通过改变它们的启动子、核糖体结合位点或进行基因突变来弱化它们的表达或弱化酶的活性。

而且，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、蜂房哈夫尼或它们的重组菌株。

而且，改造的具体步骤如下：

通过将肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA克隆至谷氨酸棒杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pepck位点上，构建出产尸胺谷氨酸棒杆菌重组菌CAD1；

将重组菌株CAD1的赖氨酸转运蛋白基因lysE敲除，构建出尸胺产量提高了的谷氨酸棒杆菌重组菌CAD2；

将重组菌株CAD2的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，构建出尸胺产量提高了的谷氨酸棒杆菌重组菌CAD3。

本发明取得的优点和积极效果：

1、本方法通过对微生物利用糖类发酵合成尸胺的代谢途径进行改造，通过改造产尸胺的微生物利用糖类发酵生产尸胺的调控位点，这些调控位点包括赖氨酸转运蛋白基因lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，通过敲除和/或弱化赖氨酸转运蛋白基因lysE和6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，可以有效提高尸胺的产量，从而提高糖类的利用率，降低生产成本。

2、本方法将赖氨酸转运蛋白基因lysE敲除并将赖氨酸-戊二胺反向转运蛋白基因cadB整合至lysE基因位点，阻止它们的表达，来抑制赖氨酸的分泌，同时加速将戊二胺转运至胞外；将乙酰转移酶基因Ncgl1469敲出可以防止尸胺的降解；将6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi敲除，切断糖代谢的糖酵解途径，从而有效提高尸胺的产量。

附图说明

图1为本发明中不同重组菌株尸胺的产量图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域内的常规方法；本发明中所使用的试剂，如无特殊说明，均为本领域内的常用试剂。

本发明所涉及的技术术语的含义：

“尸胺”即1,5-戊二胺。