[发明专利]一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用，所述重组酿酒酵母命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303‑1b，保藏编号为CCTCC NO：M 2015662，保藏日期为：2015年11月5日。本发明还公开了利用所述重组酿酒酵母制备微粒体蛋白的方法，包括以下步骤：(1)接种；(2)培养，收集菌体细胞；(3)将菌体细胞破碎；(4)第一次离心，获得上清液；(5)将沉淀剂加入上清液，第二次离心获得沉淀，即为所述的微粒体蛋白。本发明又公开了所述微粒体蛋白转化白桦脂醇生成白桦脂酸中的应用。本发明利用重组酿酒酵母培养制备的微粒体蛋白，可以转化白桦脂醇生成白桦脂酸，该方法周期短，后期处理方便，白桦脂酸得率最高可达27.5％。

技术领域

本发明涉及生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种能够催化白桦脂醇转化生成白桦脂酸的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。

背景技术

白桦脂酸(Betulinic acid，简称BA)是一类五环羽扇烷型的三萜化合物。对许多特定的肿瘤细胞如黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等、不同类型的例如人类免疫缺陷病毒、疟疾和细菌等感染剂和一般的炎性过程具有选择性细胞毒性。最近，大量的体内外实验证明白桦脂酸还具有其他临床功能。白桦脂酸可以减缓乙醇诱导的肝星状细胞的激活，通过抑制肝葡萄糖的产生来缓解高血糖症，增强免疫应答，通过抑制胰脂肪酶达到减肥的效果，还可以保护心肌免受由于缺血再灌注引起的损伤以及有助于治疗化学性的甲状腺功能低下症。

目前BA的制备方法，主要有以下三种：1直接提取法，2化学合成法，3微生物转化法。目前，白桦脂酸植物提取的主要来源是白桦树皮，但其中BA含量很低，仅为0.025％～2％。白桦脂酸早在1938年已被化学合成，均是以白桦脂醇为原料，经过一系列氧化还原反应最终生成白桦脂酸。目前，化学合成法制备白桦脂酸较多地应用于生产实践中，虽然合成效果较好，但存在操作复杂、污染大、合成成本高、安全性低等问题，限制了其在实际中的应用，有待进一步改善提高。微生物转化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化反应，因为其具有直接提取和化学合成法所不具有的方便、绿色、成本低等优点，在近年来获得了广泛关注。目前有几种真菌已被证实可以完成白桦脂醇到白桦脂酸的转化，分别为黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc)ZJUQH100-6，短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleeana)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)ZU-G1和米曲霉(Aspergillus oryzae)AS3.498，但产率仍然不能满足商业化需求。

公开号为CN101457250A的中国专利申请中公开的黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens Sacc)ZJUQH在水相体系中能催化白桦脂醇生产白桦脂酸，但有机相的底物在水相体系中溶解度不高，不但影响酶对底物的催化作用，而且对微生物细胞存在一定毒害，导致产率低，且反应时间长。后来经过改进，在公开号为CN101709322A的中国专利中使用离子液体或含离子液体的两相体系中催化反应，提高了产物的得率，反应时间缩短到6～24h，但离子液体本身价格昂贵，白桦脂酸产率虽然有所提高，但还是比较低，无法满足商业化需求。

代谢工程和合成生物学的快速发展为在微生物宿主内获得高产的天然产物提供了很好的解决方法，但现在很少有将这些技术应用到白桦脂醇的转化方面的研究。白桦脂醇转化生成白桦脂酸是C28位的羟基氧化为羧基，可通过基因工程的手段将具有C28位氧化功能的基因与相应的还原酶基因导入酿酒酵母完成转化。目前，已发现的具有C-28位氧化功能的基因有来自蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)的CYP716A12，葡萄(Vitisvinifera)的CYP716A15，人参(Panax ginseng)的CYP716A52v2和长春花(Catharanthusroseus)的CYP716AL1。

发明内容

本发明提供了一种重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母表达的微粒体蛋白能够催化白桦脂醇转化成白桦脂酸。