[发明专利]一种葡寡糖及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于农业应用技术领域，具体涉及一种微生物混合发酵制得的葡寡糖及其衍生物，以及葡寡糖的制备方法和在植物诱抗和植物保护方面的应用。

背景技术

寡糖(Oligosaccharide)又称寡聚糖或低聚糖，一般是由3～10个单糖通过糖苷键连接而成的具有直链或支链的糖类物质。根据其能否被人体代谢和吸收及其有无生物学功能，寡糖可分为普通寡糖和功能性寡糖。普通寡糖如蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖等能被人体消化吸收，是能量物质，无特殊的生理学功能。功能性寡糖一般具有低热值、味甜、粘度大、吸湿性强、不被胃肠道消化等理化特性，且易溶于水，无毒副作用，无抗原性，机体累积效应较弱，具有多种生理功能，比如改善肠道微生物区系、提高饲料利用效率、降低血清胆固醇和中性脂肪含量、提高机体免疫力、抗病毒、抗炎、及植物诱抗等。其中β-葡寡糖类激发子能激活植物自身的防御机制，诱导植物抗病信号转导和相关抗病基因的表达，而被称为“植物免疫疫苗”，具有极大的开发应用潜力。

目前寡糖的规模化应用仍然存在困难，其瓶颈因素主要在于寡糖的来源、制备方法和成本等。寡糖的制备方法包括化学合成、酶合成及多糖降解法。如中国专利CN1373134A(β-1,3-葡聚寡糖素及应用)通过化学合成法获得的β-1,3-葡寡糖可作为农作物的除菌剂用于生物农药领域，但该方法涉及多步的羟基保护、脱保护和色谱分离纯化等步骤，合成周期长，难度较大，且产率较低。目前大分子多糖降解的途径主要有化学酸水解、微生物酶解、热降解、机械降解、辐射降解等，最常用的是酸水解和酶水解法。如中国专利CN 102312021 A(一种可德兰寡糖的制备方法)采用了酸解法制备可德兰寡糖。酸解法获得的产物聚合度不均一，分子量分布较宽，难于分离纯化，且收率较低。酶解法通常具有专一性，产物结构较为均一，不破坏糖苷结构，且生产工艺清洁，副产物少，不污染环境，是制备寡糖的理想途径。但现有的酶解法受到酶来源和种类的限制，普遍存在酶解周期长、效率低和生产成本高等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡寡糖及其去修饰化衍生物，以及这些化合物的制备方法。本发明还提供上述葡寡糖及其去修饰化衍生物在植物诱抗和保护方面中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种葡寡糖，其结构式如式I所示：

上述葡寡糖为由葡萄糖单元通过6个β-1,3-糖苷键和1个α-1,3-糖苷键连接而成的线性分子，不含有支链，携带一个琥珀酰修饰基团和一个丙酮酸修饰基团。

一种上述葡寡糖通过碱水解反应去除琥珀酰修饰基团的去修饰化衍生物，其结构式如式II所示：

一种制备上述式II所示的葡寡糖的去修饰化衍生物的方法，通过碱水解反应，所用的碱为NaOH或KOH。

一种上述葡寡糖通过酸水解反应同时去除琥珀酰和丙酮酸修饰基团的去修饰化衍生物，其结构式如式III所示：

一种制备上述式III所示的葡寡糖的去修饰化衍生物的方法，通过酸水解反应，所用的酸为盐酸、硫酸、三氟乙酸或醋酸。

本发明还提供上述葡寡糖的制备方法，包括以下步骤：首先将土壤杆菌ZX09和类芽孢杆菌S09分别经固体培养基复壮，挑取单菌落至种子液中培养获得种子培养液，然后将ZX09和S09菌的种子液依次接种至混合发酵培养基中，于28～37℃下振荡培养，之后离心收集上清液浓缩后，加入乙醇沉淀得到葡寡糖粗产物，葡寡糖粗产物冻干后得到葡寡糖粗品，最后通过凝胶过滤层得到精制的葡寡糖。

本发明中所述的土壤杆菌ZX09于2010年1月21日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010020。本发明中所述的类芽孢杆菌S09已于2012年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏登记号为CCTCC M2012196。

土壤杆菌ZX09优先利用蔗糖底物生长和合成寡糖前体，供类芽孢杆菌S09进行二次代谢和加工。所述的土壤杆菌ZX09和类芽孢杆菌S09的种子液体积比为1～5:1，土壤杆菌ZX09先于类芽孢杆菌S09接种至混合发酵培养基的接种时间差为0～36h。

所述的混合发酵培养基的组成为：蔗糖20～40g/L，尿素0.7～1.0g/L，磷酸二氢钾0.5～1.0g/L，无水氯化钙0.1～0.3g/L，七水合硫酸镁0.1～0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.01～0.03g/L，氯化锌0.002～0.005g/L，硫酸锰0.001～0.003g/L，pH值为5～10。