[发明专利]一种基于RPA检测检疫性茄属杂草银毛龙葵的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物检疫领域，涉及一种基于RPA检测检疫性茄属杂草银毛龙葵的方法。

背景技术

茄属全世界有1400余种，大多起源于南美，分布广，适应性强，危害性大，其中北美刺龙葵(Solanumcarolinenes)、刺萼龙葵(Solanumrostratum)、银毛龙葵(Solanumelaeagnifolium)及水茄(Solanumtorvum)2007年被列入我国颁布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，另外有30余种具有潜在危害性。茄属分子系统学研究表明银毛龙葵属于茄亚属分支(Leptostemonum)，该分支有350-450种，在进化关系树上分属于10个亚支，银毛龙葵属于银毛龙葵亚支(ElaeagnifoliumClade)。在口岸截获发现的几乎都是只有果实和种子，几种检疫性的茄属杂草及其相近种间的种子和果实形态上十分相似，尤其是检疫性杂草鉴定到种，难度较大。因此构建茄属杂草分子检测平台，准确快速对茄属植物鉴定到种，有效防止检疫性茄属杂草传入我国，保障国门安全的意义十分重大。

传统的茄属杂草检疫鉴定方法是采用植物形态学及解剖学的方法，以植物的生长器官和生殖器官等外部形态及内部解剖结构特征结合地理分布作为划分依据，对植物种类进行鉴定、描述、命名和分类。随着分子检测技术的发展，PCR技术、DNA条形码(DNABarcoding)技术、RAPD、RFLP等分子标记技术均有用于茄属杂草的报。这些技术主要是以PCR为基础的变温扩增技术，其中RAPD图谱稳定性差，而RFLP技术耗时费力，且茄属4种检疫杂草现有的几个条形码基因变异位点固定，采用RFLP分辨难度较大。目前采用较为广泛的DNA条形码技术是采用特定基因的通用引物扩增，对获得片段进行测序，需要时间长，对于较偏远检疫部门花费时间更长，再者，目前挖掘的茄属杂草条形码基因进化相对较慢，变异较小，相似性均在92％以上，鉴定种难度较大。

目前已报道的比较成熟的等温扩增技术主要有：重组酶介导等温扩增(RecombinasePolymeraseAmplification,RPA)、链置换扩增(StrandDisplacementAmplification,SDA)、依赖核酸序列扩增技术(NucleicAcidSequence-BasedAmplification，NASBA)、滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)、环介导等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)、转录介导扩增技术(TranscriptionMediatedAmplification,TMA)、依赖解螺旋酶扩增(Helicase-DependantAmplification,HAD)、交叉引物扩增(CrossPrimingAmplification，CPA)。这些技术不需要热循环仪，只需要一个相对恒定的温度下即可以完成反应，并能通过浊度、Sybergreen显色等简单快速的指示结果，能做到快速、灵敏反应结果，是下一代快速检测的发展方向。

重组酶介导等温扩增(RPA)技术被认为是可以取代PCR的核酸检测技术。常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快核酸扩增速度。RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定银毛龙葵的引物对。

本发明所提供的用于鉴定银毛龙葵的引物对，具体可为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。

本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定银毛龙葵的重组酶介导等温扩增试剂。