[发明专利]鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法

说明书

本发明提供鸭支原体培养基，由液体培养基和固体培养基组成，液体培养基由以下组分组成：去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红，含L‑谷氨酰胺的CMRL‑1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L‑半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；除添加琼脂粉，去掉酚红外，固体培养基其余组分与液体培养基相同。利用上述培养基对鸭支原体分离纯化：在固体培养基上分离菌落，将分离的菌落置于液体培养基中生长，然后进行液体培养物的过滤、稀释、涂板和挑单菌落增殖的纯化步骤，重复上述步骤直至得到纯化的鸭支原体。本发明的培养基可促进鸭支原体的生长，且分离纯化鸭支原体的成功率高。

技术领域

本发明涉及细菌培养基及分离纯化的方法，具体涉及鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法。

背景技术

鸭支原体（Mycoplasma anatis）主要引起鸭的传染性窦炎，临床上易感染雏鸭，导致眶下窦、鼻腔、气管及气囊的炎症，其中眶下窦肿胀最为典型。当鸭支原体与其他病原（如流感病毒、大肠细菌）混合感染时，可引起鸭呼吸困难、软脚、腹泻、共济失调、斜颈、转圈或倒退运动等一系列神经系统症状，严重影响鸭的生长和发育；组织学病变表现为淋巴细胞性脑膜炎、纤维蛋白渗出性的气囊炎、间质性肺炎和淋巴滤泡性气管炎（Stipkovits，2012）。

1964年Robert首次报道从患有窦炎的小鸭中分离出鸭支原体，之后西班牙、美国等国家相继分离到鸭支原体，karpas、Amin等从北京鸭、短颈小野鸭和斑背浅鸭中分离出鸭支原体（Ivanics et al，1988；Poveda et al，1990；Goldberg et al，1995）。我国是世界上主要的鸭养殖基地，鸭肉产量占全球总量的66%；国内学者于1989年和1991年就证实了鸭支原体在我国的存在，而近两年国内有关鸭支原体合并病毒、细菌感染的病例屡见不鲜，给养鸭业造成了重大危害和经济损失，表明鸭支原体感染在我国持续时间已经很久。

鸭支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁，由于其基因组较小，造成基因组中编码氨基酸和辅助因子合成的基因就少，导致支原体生物合成和代谢的能力相当有限；由于支原体属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化做出调整，仅在特定的环境下生存，因此鸭支原体对体外培养基的选择相当苛刻，需要从中摄取脂肪酸、胆固醇、核酸前体和能量来源等营养成分促进自身繁殖。鸭支原体（Mycoplasma anatis）不同于其他禽类支原体，如鸡毒支原体（Mycoplasma gallispeticum）、滑液支原体（Mycoplasma symoviae）、泄殖腔支原体（Mycoplasma cloaclae）、莱氏无胆甾支原体（Acolaplasma laidlawii）等感染多种宿主，鸭支原体只寄生于鸭体内。关于鸭支原体的诊断，主要为聚合酶链反应（PCR）和直接免疫荧光实验（FA），二者均涉及支原体纯培养物即单个菌落的分离和培养；而目前分离鸭支原体使用的人工培养基一般均由Frey或PPLO培养基改良而来，仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等问题，易产生漏诊；因此，本领域亟需高效稳定、快速分离诊断鸭支原体的培养基以及分离纯化鸭支原体的方法，进而开展鸭支原体感染的治疗与防控研究。

发明内容

本发明提供了鸭支原体培养基，该培养基能够用来分离纯化鸭支原体，活菌滴度高，繁殖能力强；本发明还提供应用该培养基分离纯化鸭支原体的方法。

本发明为解决以上技术问题所采用的方案为：