[发明专利]一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒及其应用。

背景技术

沙雷菌是一种能引起沙雷菌肺炎和败血症的致病菌，在环境中广泛存在，主要为医院内获得性感染，发病率明显增多，且耐药菌株增多，治疗困难。与一般急性细菌性肺炎相似，主要表现为发热、寒战、咳嗽、咯血痰或假性血痰或黄痰、呼吸困难、胸痛。沙雷菌感染已成为常见的、传播广泛的条件致病菌之一，但早期诊断困难，常常导致治疗时机延误，病死率高。传统的分离、培养和病理鉴定等诊断方法敏感性低、阳性率低。早期、快速、简便、敏感、特异的诊断方法是目前条件性沙雷菌感染实验诊断研究领域的热点。

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。

发明内容

本发明需要解决的现有技术的问题是：沙雷菌感染早期诊断困难，现有技术的诊断方法敏感性低、阳性率低，导致病情延误。

为了解决上述问题，本发明提供了一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，用来解决现有的沙雷菌感染诊断困难，敏感性低、阳性率低的问题。

具体而言，本发明提供了一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。

优选的，所述特异性引物包括引物1和引物2，其中引物1的序列SQ1为：5’-cacgccatcagatgtgcc-3’；

引物2的序列SQ2为：5’-agtgtggctggtcatcctctc-3’。

优选的，所述特异性探针为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列，其中，所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种，优选为FAM、VIC；所述的淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ中的一种，优选为MGB。

优选的，所述的特异性探针的序列SQ3为：5’-ctcacctaggcgacgat-3’。

优选的，所述阳性标准品中含有插入了沙雷菌特异性DNA序列SQ4的重组质粒，其中，SQ4的序列如下：

cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg60

ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag120

acacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcc180

优选的，所述重组质粒的浓度为1.0×10³～1.0×10⁷。

优选的，所述的阴性标准品包含有不含沙雷菌特异性DNA序列的质粒。

优选的，所述的质粒或重组质粒相同，选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322、pMD-T中的一种，优选为pGM-T、pBR322。

优选的，所述的反应液还包括缓冲液和dNTPs。

优选的，所述的缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。

优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷的浓度为50～200mM，优选为100～150mM；氯化钾的浓度为300～800mM，优选为400～600mM；氯化镁的浓度为10～30mM，优选为10～20mM。

优选的，所述的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。

本发明同时提供了引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3用于制备沙雷菌含量测定用试剂中的应用。

优选的，所述的沙雷菌含量测定用试剂的使用方法如下：

取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准品以及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行荧光定量PCR反应，其中反应液、阳性标准品、阴性标准品中均含有引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3。

优选的，所述的荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94～95℃15～20s、55～60℃30～50s，40～50个循环。