[发明专利]一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。

2.根据权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述特异性引物包括引物1和引物2，其中引物1的序列SQ1为：5’-cacgccatcagatgtgcc-3’；

引物2的序列SQ2为：5’-agtgtggctggtcatcctctc-3’。

3.根据权利要求1或2所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述特异性探针为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列，其中，所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种，优选为FAM、VIC；所述的淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ中的一种，优选为MGB。

4.根据权利要求1-3任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的特异性探针的序列SQ3为：5’-ctcacctaggcgacgat-3’。

5.根据权利要求1-4任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品中含有插入了沙雷菌特异性DNA序列SQ4的重组质粒，其中，SQ4的序列如下：

cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg60

ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag120

acacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcc180

6.根据权利要求5所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述重组质粒的浓度为1.0×10³～1.0×10⁷。

7.根据权利要求1-5任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的阴性标准品包含有不含沙雷菌特异性DNA序列的质粒。

8.根据权利要求5-7任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的质粒或重组质粒相同，选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322、pMD-T中的一种，优选为pGM-T、pBR322。

9.根据权利要求1-8任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的反应液还包括缓冲液和dNTPs。

10.根据权利要求9所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。

11.根据权利要求10所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的三羟甲基氨基甲烷的浓度为50～200mM，优选为100～150mM；氯化钾的浓度为300～800mM，优选为400～600mM；氯化镁的浓度为10～30mM，优选为10～20mM。

12.根据权利要求1-11任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。

13.引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3用于制备沙雷菌含量测定用试剂中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的沙雷菌含量测定用试剂的使用方法如下：

取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准品以及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行荧光定量PCR反应，其中反应液、阳性标准品、阴性标准品中均含有引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94～95℃15～20s、55～60℃30～50s，40～50个循环。