[发明专利]一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及核酸提取技术，特别涉及一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒。

背景技术

1948年Mandel和Metais首次报道游离核酸至今，游离核酸研究已有近70年历史，但因当时核酸是否是遗传物质而没有引起人们的广泛关注。1970年，欧洲学者首次报道肿瘤病人的血浆或血浆中存在游离DNA，其含量为健康人群的10倍左右，其为双链DNA分子，长度基本在500bp以下，大部分以核小体形式存在。大量研究证明，游离DNA与肿瘤基因组DNA具有相同的遗传变异，例如，基因突变、基因启动子甲基化等，因此，游离核酸可被用于一种预测肿瘤发生的新型标记物。1997年，Lo等首次证明孕妇外周血存在胎儿游离DNA，为非创伤产前诊断开辟了一条新途径。存在于血浆或血清中来源于肿瘤细胞的游离DNA主要来源于：肿瘤细胞的凋亡、坏死释放到血液中和肿瘤细胞的转移、增殖释放到血液中。

近年来，游离DNA研究成为基因组分子诊断研究的一个热门领域，首先其可作为一种无创诊断方法，可以随时采集患者样本进行相关检测分析。其次，其可作为一类新型生物标志物，因其具有与肿瘤细胞基因组相同的遗传变异，具有显著的特异性，可以对肿瘤进行分型及早期筛查。因此，循环游离DNA的检测在临床诊断上具有非常重要的应用价值，如癌症早期筛查、肿瘤复发、疗效监控等。游离DNA研究的主要障碍为：游离DNA的分离纯化和高灵敏度检测。因游离DNA在血液中的含量低，且片段长度短，为游离DNA研究带来比较大的困难。

目前核酸提取方法主要有酚氯仿抽提、离心柱法和磁珠法。酚氯仿抽提因大量使用有毒溶剂，对操作者毒性较大，且难于实现自动化操作。离心柱法因其游离核酸提取效率低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，均不能广泛适用于大规模的临床检测。近年发展起来的磁珠法提取核酸技术，其采用超顺磁性纳米颗粒，利用在高盐低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，因其只需要在磁场作用下就能将核酸分离纯化出来，故其能实现高通量自动化标准化操作。而目前市场上的基于磁珠法的商品化试剂操作过于复杂，并且需要一定温度下使用蛋白酶K及carrierRNA进行孵育，同时需要多步洗涤等步骤，导致其自动化程度偏低，核酸提取的重复性差及提取效率低；而且提取的样本量基本在0.1-1.2ml，难于满足一些循环肿瘤DNA研究应用。

专利申请号为201410292018.3的发明专利公开了一种外周血胎儿游离DNA提取方法，包括以下步骤：1)取2～10ml孕妇外周血，3～6℃1600g离心8-12min，将上清液于3～6℃16000g离心8-12min后再取上清液；2)取步骤1)中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55～62℃孵育30min；3)把步骤2)得到的样品在冰上冷却，然后加入NH₄AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心4-6min；4)转移步骤3)上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育10min；5)将步骤4)得到样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清；6)将步骤5)得到的上清与1.5倍体积磁珠混悬液室温孵育10min，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75％酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体；7)采用DNA洗脱液，将步骤6)获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。

上述专利公开的游离DNA提取方法仍存在操作复杂、重复性差、提取效率低以及提取的样本量少的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种提取效率高、操作简便且适用于大样本量的磁珠法提取游离核酸的方法，进一步针对上述方法提供一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种磁珠法提取游离核酸的方法，于0.2-5ml样本中加入0.3-7.5ml裂解结合液和20-40ul磁性纳米颗粒，混合10-20min后进行第一次磁分离处理，2-5min后弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.5-1ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，2-5min后弃去第二次磁分离处理后的上清液，然后加入40-100ul洗脱液，混合后静置5-10min，所述静置的温度为20-65℃，然后进行第三次磁分离处理，1-2min后取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；