[发明专利]一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，于0.2-5ml样本中加入0.3-7.5ml裂解结合液和20-40ul磁性纳米颗粒，混合后进行第一次磁分离处理，弃去第一次磁分离处理后的上清液，然后加入0.5-1ml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，弃去第二次磁分离处理后的上清液，然后加入40-100ul洗脱液，混合后静置5-10min，所述静置的温度为20-65℃，然后进行第三次磁分离处理，取第三次磁分离处理后的上清液，即获得所述游离核酸；

所述裂解结合液包括0.5-6M的A试剂、0.5-10％体积浓度的B试剂、10-50％体积浓度的C试剂混合制得，所述A试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述B试剂为tween20、triton-X100、SDS和NP40中的至少一种，所述C试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述裂解结合液的pH值为5-7；

所述洗涤液包括0.5-3M的D试剂和10-70％体积浓度的E试剂混合制得，所述D试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍和高氯酸钠中的至少一种，所述E试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述洗涤液的pH值为5-7。

2.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述洗脱液为无DNase和RNase酶的无菌水或者Tris缓冲液或者TE缓冲液，所述Tris缓冲液为摩尔浓度为1-10mM的Tris-HCl，所述Tris缓冲液的pH值为7.5-8.5，所述TE缓冲液为10mM的tris-HCl与1mM的EDTA混合物，所述的TE缓冲液的pH值为7.5-8.5。

3.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰由羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。

4.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，将混合后的所述样本、裂解结合液和纳米磁性颗粒于20-30℃条件下振荡10-20min。

5.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，先将第二次磁分离处理后获得的磁珠分离物静置1-5min，弃去上清液后再加入洗脱液。

6.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，将第三次磁分离处理后的上清液转移至无DNase和RNase酶的离心管中，于-20℃条件下进行保存。

7.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述第一次磁分离处理的时间为2-5min，所述第二次磁分离处理的时间为2-5min，所述第三次磁分离处理的时间为1-2min。

8.根据权利要求1所述的磁珠法提取游离核酸的方法，其特征在于，所述样本为无白细胞血浆或者无白细胞血清。

9.一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液、磁性纳米颗粒、洗涤液和洗脱液；

所述裂解结合液包括0.5-6M的A试剂、0.5-10％体积浓度的B试剂、10-50％体积浓度的C试剂混合制得，所述A试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一种，所述B试剂为tween20、triton-X100、SDS和NP40中的至少一种，所述C试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述裂解结合液的pH值为5-7；

所述洗涤液包括0.5-3M的D试剂和10-70％体积浓度的E试剂混合制得，所述D试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍和高氯酸钠中的至少一种，所述E试剂为异丙醇和无水乙醇中的至少一种，所述洗涤液的pH值为5-7。

10.根据权利要求9所述的磁珠法提取游离核酸的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无DNase和RNase酶的无菌水或者Tris缓冲液，所述磁性纳米颗粒为超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒，所述超顺磁性四氧化三铁颗粒或超顺磁性三氧化二铁颗粒的表面分别修饰有羟基或羧基，并且由二氧化硅包裹。