[发明专利]酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法

说明书

本发明涉及一种酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法及其应用。利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体为催化剂，催化烟酰胺单核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸耦合反应，制备烟酰胺尿嘧啶二核苷酸。在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸，并且胞内烟酰胺尿嘧啶二核苷酸可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。在一个典型实例中，琥珀酸产量提高了35％。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(nicotinamide uracil dinucleotide，NUD)的方法及其应用，在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成NUD，并且胞内NUD可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态(NADH)在细胞的繁殖，生长，分化，凋亡等生命活动中都起着非常重要的作用(W.Ying，et al.Antioxidants RedoxSignaling.2008，10，179)。除此之外，NAD还是许多重要氧化还原酶的辅酶，起传递氢和电子的作用。其结构式如下：

由于生物体内NAD(H)同时参与多种反应，因此在大部分目标产物的生物代谢网络中，都会存在一步或多步利用NAD(H)的反应。现阶段通常采用辅因子工程对目标代谢网络进行调控。常见的策略有，1)改变胞内辅酶合成，降解，回补代谢和不同辅酶分子相互转化的能力，2)改变氧化还原酶的辅酶偏好性，3)在细胞内表达可再生辅酶的酶，如葡萄糖脱氢酶等，并在培养环境中额外添加相应酶的底物。但是，由于NAD(H)是一种通用的辅酶，胞内NAD(H)水平及不同氧化态的扰动往往会对细胞生理及代谢等产生难以预测的全局性影响。因此，为了实现特异性调控目标代谢网络，亟需一种方法使目标代谢网络从复杂代谢网络中独立出来，即需要重新设计出一个生物正交系统(K.Shokat，et al.Drug DiscoveryToday.2002，7，872)。

在依赖于NAD类似物的生物正交系统中，NAD(H)类似物可以在该正交代谢途径中传递，而不影响其他利用NAD(H)的代谢途径，同样，其他代谢途径中的NAD(H)也不会影响到生物正交代谢途径。因此，仅靠调控NAD(H)类似物的含量就可以对生物正交系统进行特异性的代谢调控，从而达到提高目标途径产量的目的。

由于依赖于NAD(H)的氧化还原酶与其辅酶的主要结合作用发生在腺嘌呤结合域，吡啶环部分主要起传递电子的作用，因此，为了保证NAD类似物的氧化还原性能，只能对NAD的腺嘌呤环部分进行改造。

目前，大多数NAD类似物均采用化学法合成。但是，化学法合成NAD类似物通常面临步骤繁琐，化学性质不稳定，分离，纯化较困难，且成本较高，不能直接应用于生物体等问题。因此，有人采用酶促方法合成NAD类似物(H.迪费尔，D.海因德尔，C.迈尔，R.施姆克，CARBA-NAD的酶促合成，申请号：201080033434.1)。其借助野生型烟酰胺核糖激酶(RNK)和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)进行NAD类似物的酶促反应合成。其中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)根据物种来源不同，分别可由基因nadD，nadM，nadR表达，将烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)或烟酸单核苷酸(nicotinic acidmononucleotide，NaMN)和腺苷三磷酸(ATP)进行缩合反应合成NAD或NaAD，是NAD生物合成途径中的关键酶。虽然在体外反应条件下，野生NMNAT也可表现出很低的合成少数NAD类似物的活性(M.Emanuelli，et al.Protein Expression and Purification.2003，27，357)，但不足以用于制备或进行胞内直接合成NAD类似物。