[发明专利]酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法

权利要求书

1.一种酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺单核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸；

所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体为：

将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变，突变位点选自以下任意一组：

（1）118位突变为H、175位突变为K以及176位突变为R；

（2）132位突变为I、175位突变为M以及176位突变为S；

（3）22位突变为A、82位突变为K以及84位突变为K；

（4）86位突变为F、109位突变为G以及118位突变为N；

（5）22位突变为G、107位突变为V以及174位突变为R；

（6）174、175和176位缺失突变为PG；

（7）23位突变为G以及118位突变为H；

或，将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变，突变位点选自以下任意一组：

（1）198、199和200位缺失突变为AY；

（2）176和177位插入突变为PAS；

（3）83位突变为R以及205位突变为N；

（4）203、204和205位缺失突变为EG；

或，将氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变，突变位点选自以下任意一组：

（1）131位突变为P；

（2）21位突变为R以及110位突变为S；

（3）110位突变为L以及133位突变为E；

（4）132位突变为R。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体由相应的DNA序列编码。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征还在于：所述编码烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的DNA序列，克隆在一种蛋白质表达载体中，用于可控表达。

4.按照权利要求1所述酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸方法，其特征还在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，纯化相应突变体，并用于体外酶促反应合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸。

5.按照权利要求1或4所述酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸方法，其特征还在于：反应条件为：pH 5.0-9.0，温度25 ℃-40 ℃，时间0.2-30 h；烟酰胺单核苷酸，尿嘧啶核苷三磷酸，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体三者的用量摩尔比例为1:0.02-50:0.00002-0.1。

6.按照权利要求1所述酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：在微生物细胞中表达权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，同时表达以烟酰胺尿嘧啶二核苷酸为辅酶的一种或两种以上蛋白，构建可被选择性调控的代谢体系，用于提高目标代谢产物产量。

7.按照权利要求1所述酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：在大肠杆菌工程菌中表达权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，同时表达以烟酰胺尿嘧啶二核苷酸为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸的苹果酸酶突变体和来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体，并在亚磷酸存在下培养工程菌细胞，提高琥珀酸产量。

8.按照权利要求1所述酶促合成烟酰胺尿嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体任选自氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体或其组合。