[发明专利]人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法

说明书

本发明涉及细胞冻存复苏诱导技术领域，特别涉及一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法：PBMC的分离与冻存：冻存母液组成为DMSO和低分子量40KD右旋糖苷,甘油磷脂，EG；PBMC的复苏；复苏后向AIL诱导：诱导因子为IFN‑γ、ATP、IL‑1α、IL‑2、IL‑7、CD3单抗、CD28。本发明中复苏的细胞存活率94.2%±3.42%，利用冻存技术保存了PBMC的细胞活性，复苏后诱导为AIL细胞的比率为53.1%，活化率高，从而提高了采集的外周血单个核细胞的复苏和诱导活化率。

技术领域

本发明涉及细胞冻存复苏诱导技术领域，特别涉及一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法。

背景技术

1970年Burnet提出了免疫监视机制，发现在特异性免疫中扮演重要角色的T细胞，可在异常生长细胞或是肿瘤细胞大量繁殖前便加以消灭、清除。已知临床上应用患者的免疫细胞进行免疫治疗具有一定疗效，但此时人体的免疫细胞活性较低，因而影响免疫治疗效果，也很难保证患者在最需要的时候(如放化疗后)提供足够数量的细胞，如果能预先储存健康的免疫细胞，当日后患者需要治疗时，复苏诱导为杀伤细胞，不仅能为患者节约费用，还可减轻患者的痛苦。随着年龄增长，免疫细胞逐渐退化，这也是为什么癌症、传染病及慢性疾病大多伴随着老化而来，储存免疫细胞并定期回输，可有效调节活化免疫功能，清除早期病变细胞。另外，免疫细胞需多次输注才能达到较好的治疗效果，多数医疗单位利用血细胞分离机采集单个核细胞，而这种采集方法价格昂贵，且多次采集给患者带来身心痛苦。

公开号为CN104719282A的中国发明专利申请，公开了一种外周血单个核细胞无血清冻存液，其按体积分数计包括以下组分：5～20％的二甲基亚砜、0.5～10％右旋糖酐40，余量为勃脉力A。还公开了采用上述外周血单个核细胞无血清冻存液冻存外周血单个核细胞的方法。与现有技术相比，本发明的冻存液不含动物血清、人血清、细胞培养基，且冻存效果良好，细胞复苏后既可直接用于临床，又可在体外诱导成免疫细胞NKT、CIK，在临床上颇具应用价值。但其冻存后复苏活率平均只有84.03％。诱导后的NKT细胞培养14天后，CD3+CD56+细胞为32.7％，显示诱导效果良好。

发明内容

为了解决以上现有技术中外周血单个核细胞冻存复苏活率低，诱导活化率低的问题，本申请提供了一种冻存复苏成活率高，诱导活化率高的人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导，本发明涉及冻存技术一种新的应用，利用低温冻存技术保存人体外周血单个核细胞，需要时复苏并诱导为杀伤细胞，不但可以实践疾病预防的概念，更能提升预防医学的价值题。预先储存健康的免疫细胞，当日后患者需要治疗时，复苏诱导为杀伤细胞，不仅能为患者节约费用，还可减轻患者的痛苦。

一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法，包括以下步骤：

(1)PBMC的分离与冻存：用淋巴细胞分离液分离人体外周血单个核细胞，离心弃上清，细胞沉淀用冷冻保存液悬浮，冷冻保护液为500ul细胞培养液，再加等体积的冻存母液，放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪，最终将细胞保存于-196℃液氮内，冻存母液组成为20％-40％DMSO和低分子量(40KD)右旋糖苷70％-40％,5％-10％甘油磷脂，5％-10％EG。

(2)PBMC的复苏：将装有待复苏人体外周血单个核细胞的冻存管放入37℃水中，并不断摇动，保证管内液体在1min内80％溶解，然后将复苏的人体外周血单个核细胞加入装有DMEM培养基的离心管中离心，去上清，得到复苏的PBMC；