[发明专利]人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法

权利要求书

1.一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）PBMC的分离与冻存：用淋巴细胞分离液分离人体外周血单个核细胞，离心弃上清，细胞沉淀用冷冻保存液悬浮，冷冻保护液为500μL细胞培养液，再加等体积的冻存母液，放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪，最终将细胞保存于-196 ℃液氮内，冻存母液体积百分比组成为30%DMSO和低分子量40KD右旋糖苷50%，10%甘油磷脂，10%EG；

（2）PBMC的复苏：将装有待复苏人体外周血单个核细胞的冻存管放入37℃水中，并不断摇动，保证管内液体在1min 内80%溶解，然后将复苏的人体外周血单个核细胞加入装有DMEM培养基的离心管中离心，去上清，得到复苏的PBMC；

（3）复苏后向AIL诱导： PBMC按照细胞密度(0.4-1.2)×10⁶/mL用X-VIVO15重悬，添加300-2000U/mL IFN-γ和50-100U/mL ATP诱导培养AIL细胞，第二天补加因子50-200U/mLIL-1α、500-2000U/mL IL-2、500-1000U/mL IL-7、50-200ng/mL CD3单抗、50-200ng/mLCD28；

此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有500-2000U/mL IL-2的X-VIVO15 培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中PBMC按照细胞密度1×10⁶/mL用X-VIVO15重悬，添加1000U/mL IFN-γ和80U/mL ATP诱导培养AIL细胞，放置37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，第二天补加因子120U/mL IL-1α、1100U/mL IL-2、800U/mL IL-7、130ng/mLCD3单抗、110ng/mL CD28。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中PBMC复苏效率85%-99%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中冻存细胞密度控制在10⁷-10⁸个/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中降温梯度如下：

a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；

b．以5℃/min 降至0℃，保持5min；

c．以2℃/min 降至-10℃，保持5min；

d．以1℃/min 降至-45℃，保持35min；

e．以5℃/min 降至-90℃，保持5min；

f．结束。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中诱导培养12-20天。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中离心速率1800rpm/min，时间8min，步骤（2）中离心速率1000rpm/min，时间5min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于储存的外周血单个核细胞接收标准：细胞总数MNC≥2×10⁸，WBC≥4×10⁸，细胞活性≥95%。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于储存的外周血单个核细胞入库标准：细胞总数MNC≥1×10⁸，细胞活性≥90%；出库标准：细胞总数MNC≥0.2×10⁸，细胞活性≥90%。