[发明专利]一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于试剂盒领域，特别涉及一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法。

背景技术

Dubin-Johnson综合征(DJS)是一种少见的以慢性持续性或间歇性黄疸为临床特点的常染色体隐性遗传病，以结合胆红素增高为主的先天性非溶血性黄疸。由Dubin和Johnson于1954年首先报道，常见于青少年和幼年。复合耐药相关蛋白2MRP2(编码基因ABCC2)，是ATP依赖的有机阴离子的重要转运体，如二葡萄糖苷酸胆红素、硫酸盐、还原型谷胱甘肽等的转运，是非胆汁酸盐依赖性胆汁流形成的重要因素。由于毛细胆管上位于10q24的多特异性有机阴离子转运蛋白(cMOAT)的基因(ABCC2/MRP2超家族)缺陷，导致毛细胆管对有机阴离子尤其是两性化合物如二葡萄糖苷酸胆红素转运异常，肝细胞先天性胆红素排泌障碍，对非水溶性有机阴离子的排泄也有缺陷，但对胆盐的排泌正常，导致DJS。

本病较罕见，以多见于男性。Dubin-Johnson4000例肝脏活体组织检查中有12例(0.3％)，美国肝病登记8000例有23例(0.29％)，国内也有本病的报导，发病率亦不高。本综合征的临床表现大致有三种类型:第一种是临床无任何自觉症状，常因其它疾病就诊而被发现，此类少见。第二种是长期黄疸反复发作，食欲不振、疲乏无力，肝区不适，恶心甚至呕吐，尿色加深，酷似病毒性肝炎。此类最常见。第三种是持续黄疸不退，尿色深黄，但胃肠症状不明显，可应付日常工作。DJS常见于青少年，因为该疾病症状轻微，医生或患者对该疾病认识不足不予重视，导致患者长期误诊。

ABCC2基因位于染色体10q24，为45kb，包括32个外显子，不同的种族存在不同的MRP2/ABCC2基因突变类型。ABCC2基因在1066密码子突变，使4个跨膜区和整个第2个三磷酸腺苷结合位点缺失，从而丧失转运非胆汁酸有机阴离子的功能。最新报道表明ABCC2基因第17号外显子错义突变和第28外显子无义突变共同引起杂合性突变，也可导致MRP2蛋白功能丧失，使二葡萄糖苷酸胆红素转运异常，从而引起DJS。

明确诊断可以避免反复就诊和不必要的治疗，以及避免其加重损害的因素。通过对ABCC2基因的检测，尤其是编码MRP2段基因的检测有助于诊断DJS，减少误诊的发生。Sanger测序法是目前公认的，是大多数临床分子诊断项目的金标准，特异性甚至能达到100％，是分子诊断方面的经典技术平台。因此采用Sanger测序法对编码MRP2的基因ABCC2的序列进行突变检测，具有稳定性高，特异性好的优点，能够有效避免假阳性的产生。

为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目的特点，建立一个稳定可靠的PCR体系。该项目PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液全基因组DNA，由于临床标本物流运输中存在众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量优良的全血标本，因此获得的DNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于需检测的外显子数目较多，即PCR目的片段过多，导致PCR条件不统一。

溶解温度(Tm)是PCR中一个很重要的参数，是50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，对于设定PCR退火温度是必须的，合适的退火温度能够有效的减少非特异性结合，还能保证目的序列有效退火。所以在保证特异性的情况下，设计引物的Tm值尽量接近，使PCR的退火温度可以保持一致，从而达到PCR条件的统一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测ABCC2基因的突变位点，特异性好，灵敏度高。

本发明的一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中ABCC2基因扩增的PCR引物；其中，PCR引物如下：

ABCC2-3F：CCTATCCATCACCGGAAACC；

ABCC2-3R：TGTTTCACCCCATTCCAACC；

ABCC2-7F：TATCGACAAGATCGCAACTCC；

ABCC2-7R：ATCTTCCGCTGGCAATCA；

ABCC2-8F：TGGAACAGTGAAGGCAGC；

ABCC2-8R：CATCTTGAAAACTGCCTGC；

ABCC2-9F：GCTAGATGCGATGGCGTATG；