[发明专利]用于菌种保藏的保藏液及重组大肠杆菌高密度发酵方法

说明书

技术领域

本申请涉及菌种保藏领域，特别是涉及一种用于菌种保藏的保藏液，以及基于该保藏液的重组大肠杆菌的高密度发酵方法。

背景技术

重组大肠杆菌，是指以大肠杆菌为宿主，导入重组DNA后，能够有效表达外源蛋白的一大类基因工程菌，由于所采用的宿主均为大肠杆菌，因此，统称为重组大肠杆菌。

目前重组大肠杆菌主要应用到生物制药领域。在生产过程中发现重组大肠杆菌稳定性不高，在生产过程中，易发生菌种衰退现象，主要原因是，①传统菌种保藏方法，因为冻存于-80℃冰箱中，无法长期保持菌体的活力，菌种的活力衰退易导致菌体自溶、菌体质粒丢失等问题，从而导致目标代谢产物的产量下降；②在发酵过程中，传统发酵方法和补料方法无法达到高菌体密度，使得产品产量的提升受到制约。另外，传统的菌种保藏都需要将菌种保藏在-80℃。

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高外源表达蛋白产量和质量的一个非常有效的手段，也是目前发酵工程研究的热点和难点。现有研究显示，影响重组大肠杆菌高密度发酵的因素主要包括，宿主菌本身的外源基因表达能力、环境耐受力等，以及培养基、培养条件、补料方法等。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于菌种保藏的保藏液及重组大肠杆菌高密度发酵方法，旨在有效的保持菌种活力，降低了发酵过程中由于菌种活力退化导致的生产异常现象。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于菌种保藏的保藏液，该保藏液由缓冲溶液和溶解于缓冲溶液中的溶质组成，缓冲溶液为pH值6.2-7.0的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液，溶质包括低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。

需要说明的是，采用本申请的保藏液对菌种进行保藏时，可以不用-80℃保藏，直接在0-26℃保存，特别是，对于工作菌种库，但本领域技术人员可以理解，采用本申请的保藏液保存菌种也可以保存于-80℃。在本申请的一种优选方案中，将工作菌种库于4-10℃保藏，一方面降低了保藏成本，另一方面，在4-10℃下，能够更长时间的保持菌体活力，从而为高密度发酵奠定了基础，本申请的 一种实现方式中，菌体538天的存活率在74.8％以上。

优选的，低聚糖选自海藻糖、蔗糖和麦芽糖中的至少一种。

优选的，溶质中包括100重量份的低聚糖，30-40重量份的甘油，50-60重量份的甘露醇，180-200重量份的脱脂奶粉，0.5-0.8重量份的琼脂糖。

优选的，保藏液中，缓冲溶液和溶质的重量比为1:8-15。

本申请的另一面公开了本申请的保藏液在重组大肠杆菌的菌种保藏中的应用。

本申请的另一面还公开了本申请的保藏液在基因工程菌的高密度发酵中的应用。

需要说明的是，本申请的保藏液是特别针对重组大肠杆菌的高密度发酵而改良的，可以理解，本申请的保藏液并不仅限用于重组大肠杆菌；其它的基因工程菌，都可以采用本申请的保藏液。

本申请的再一面公开了一种重组大肠杆菌的高密度发酵方法，包括采用三级菌种保藏方法建立原始菌种库、主代菌种库和工作菌种库，工作菌种库采用本申请的保藏液，保存于-80℃-26℃，优选的保存于0-26℃；并且，采用工作菌种库的菌种进行高密度发酵，高密度发酵依序包括划线培养、摇床活化培养、种子液培养、种子罐培养和发酵罐培养。